氟西汀对单眼剥夺弱视大鼠视皮质神经细胞突触可塑性的影响及相关机制

罗贤令 吴罗玲

杭州市富阳区第一人民医院眼科，浙江杭州 311400

弱视影响儿童视功能健康发育，对双眼视功能及立体视觉具有影响[1-2]。研究显示，视皮层形态结构改变导致视皮层可塑性降低是弱视发生的关键原因[3-4]。治疗多采用常规遮盖疗法、精细目力训练等治疗，但存在时限性等问题，且对于超过视觉发育敏感期的患者，治疗效果甚微[5-7]。氟西汀是抗抑郁药物，其可增加成年弱视大鼠视皮层神经元可塑性，但具体机制尚未阐明[8]。研究显示，促进ERK/CREB 通路活化可激活脑缺血再灌注大鼠神经元突触可塑性，改善小鼠神经功能[9]。氟西汀能够激活CREB 通路，改善慢性应激大鼠神经功能[10]。目前，有关氟西汀对弱视视皮层神经元可塑性的影响是否与调控ERK/CREB 通路有关少见报道，本研究对此进行探究。

1 对象与方法

1.1 试验动物

60 只14 日龄SPF 级SD 雄性大鼠，体重（55±10）g，购于北京唯尚立德生物科技有限公司，使用许可证号SYXK（京）2021-0056，生产许可证号SCXK（京）2016-0009。本研究经杭州市富阳区第一人民医院医学伦理委员会审批通过（CX-006-03）。

1.2 主要试剂与仪器

氟西汀（生产批号：114247-09-5，海思生物技术有限公司）；醋酸双氧铀（生产批号：CAS6159-44-0，青岛捷世康生物科技有限公司）；复方托吡卡胺滴眼液（生产批号：14200529809，华润双鹤药业股份有限公司）；左旋多巴（生产批号：CCPE900086，广州佳途科技股份有限公司）；兔抗鼠ERK1/2（生产批号：33047M）、p-ERK1/2（生产批号：33016M）、CREB（生产批号：33052M）、p-CREB（生产批号：33008M）及β-actin（生产批号：33036M）多克隆抗体、山羊抗兔HRP 二抗（生产批号：33141M）均购于上海雅吉生物科技有限公司。

IX-RA-834 型小动物多功能图形翻转视觉诱发电位仪（上海玉研科学仪器有限公司）；BD-4R 型透射式电子显微镜（深圳市博视达光学仪器有限公司）。

1.3 动物分组及建模

60 只大鼠选取10 只为对照组，余50 只建立单眼弱视模型并检验建模是否成功。具体操作见文献[11]。建模成功的50 只大鼠按照随机数字法分为阳性药组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组10 只。

1.4 药物处理

低、中、高剂量组大鼠于之后每日早8:00 腹腔注射氟西汀5、10、20 mg/（kg·d）[12]，模型组、对照组腹腔注射等量生理盐水，阳性药组大鼠灌胃左旋多巴80 mg/（kg·d），给药28 d。

1.5 图形视觉诱发电位（pattern visual evoked potential，PVEP）检测各组大鼠P100 潜伏期、P100 幅值

各组大鼠末次给药结束后进行PVEP 检测：剪开大鼠缝合的眼睑缘，暗室内适应30 min，1%戊巴比妥钠将大鼠麻醉后，一次性给予复方托吡卡胺滴眼液充分扩瞳，然后采用多功能图形翻转视觉诱发电位仪（闪烁光为刺激光，频率为1.0 Hz，通频带宽0.5～85.0 Hz，分析时间250 ms，叠加60 次）进行PVEP 检测，连续测3 次取平均值，比较分析各组大鼠P100潜伏期、P100幅值，具体操作见文献[13]。

1.6 透射电子显微镜观察视皮层神经元细胞突触超微结构

PVEP 检测结束后，立即处死大鼠，取大脑左侧视皮层组织，分为两部分。其中一部分经2.5%戊二醛、磷酸盐缓冲液固定2 h，1%锇酸固定液固定3 h，梯度乙醇脱水、透明、石蜡包埋过夜，连续切片（50 nm厚），3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，于透射电子显微镜下观察皮层突触超微结构，并利用IPP 6.0 图像分析软件（美国MedrnCybernetics 公司）分析并记录各组大鼠视皮层神经元突触间隙及突触后致密物厚度。

1.7 免疫印迹法检测视皮层组织中ERK/CREB 通路蛋白水平

将另一部分视皮层组织制备组织匀浆，提取总蛋白并检测浓度及纯度，电泳、转膜、脱脂奶粉（5%）室温封闭2 h，分别加入一抗ERK1/2、p-ERK1/2、CREB、p-CREB及内参β-actin（1∶1 000）的稀释比，次日加入HRP 标记山羊抗兔二抗（1∶5 000），室温孵育2 h，显色、显影、定影，根据各蛋白条带灰度值计算各目标基因蛋白相对表达量。

1.8 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验；两组间比较采用t检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠P100 潜伏期、P100 幅值比较

模型组大鼠P100潜伏期高于对照组，P100幅值低于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。低、中、高剂量组大鼠P100潜伏期低于模型组，P100幅值高于模型组；中、高剂量组大鼠P100潜伏期低于低剂量组，P100幅值高于低剂量组；高剂量组大鼠P100潜伏期低于中剂量组，P100幅值高于中剂量组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠P100 潜伏期、P100 幅值比较（）

表1 各组大鼠P100 潜伏期、P100 幅值比较（）

注与对照组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05；与低剂量组比较，cP ＜0.05；与中剂量组比较，dP ＜0.05

2.2 各组大鼠视皮层神经细胞突触超微结构变化

对照组大鼠视皮层神经元结构正常；模型组大鼠突触结构模糊，突触间隙消失，突触小泡隐约可见，髓鞘板层结构松解，细胞电子密度降低，突触结构出现病理损伤；与模型组比较，低、中、高剂量组大鼠视皮层神经元突触结构稍清晰，可见突触间隙及突触小泡，髓鞘板层结构清晰。见图1。

图1 各组大鼠视皮层神经细胞突触超微结构变化（400×）

2.3 各组大鼠视皮层突触间隙及突触致密厚度比较

模型组大鼠突触间隙与突触致密厚度高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。低、中、高剂量组大鼠突触间隙与突触致密厚度低于模型组；中、高剂量组大鼠突触间隙与突触致密厚度低于低剂量组；高剂量组大鼠突触间隙与突触致密厚度低于中剂量组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠视皮层突触间隙及突触致密厚度比较（）

表2 各组大鼠视皮层突触间隙及突触致密厚度比较（）

注与对照组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05；与低剂量组比较，cP ＜0.05；与中剂量组比较，dP ＜0.05

2.4 各组大鼠视皮层ERK/CREB 通路蛋白比较

模型组大鼠视皮层组织p-ERK1/2/ERK1/2、p-CREB/CREB 低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。低、中、高剂量组大鼠视皮层组织p-ERK1/2/ERK1/2、p-CREB/CREB 高于模型组；中、高剂量组大鼠视皮层组织p-ERK1/2/ERK1/2、p-CREB/CREB 高于低剂量组；高剂量组大鼠视皮层组织p-ERK1/2/ERK1/2、p-CREB/CREB 高于中剂量组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图2、表3。

图2 各组大鼠视皮层组织中ERK/CREB 通路蛋白

表3 各组大鼠视皮层ERK/CREB 通路蛋白水平比较（）

表3 各组大鼠视皮层ERK/CREB 通路蛋白水平比较（）

注与对照组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05；与低剂量组比较，cP ＜0.05；与中剂量组比较，dP ＜0.05

3 讨论

弱视与视觉发育相关，多发于儿童[14]。由视觉发育关键期内不良的视环境及单眼斜视、形觉剥夺等多种因素引起的单眼或双眼最佳矫正视力下降[15-16]。常规治疗方法存在时限性，且治疗效果不佳[17-18]。氟西汀是抗抑郁药，其对单眼形觉剥夺大鼠视觉可塑性有调控作用，但机制尚未明确[19-20]。视觉系统能够根据外界视觉环境的刺激调整和改变突触结构，此过程为视觉发育可塑性。研究表明，视皮层神经元突触发育可塑性在弱视发生发展过程中发挥关键作用[21]。

PVEP 的主要波形P100波及其波幅能反映视神经轴索及视神经传导功能[22]。本研究结果显示，模型组大鼠P100潜伏期高于对照组，P100幅值低于对照组；低、中、高剂量组大鼠P100潜伏期低于模型组，P100幅值高于模型组。提示氟西汀可能拮抗视觉剥夺对视觉系统的损害，促进视神经鞘膜与轴索功能恢复。突触是神经元之间传递信息的重要结构，其结构异常改变能使神经系统结构及功能发生改变。本研究结果显示，模型组大鼠突触间隙与突触致密厚度高于对照组；低、中、高剂量组大鼠突触间隙与突触致密厚度低于模型组。提示氟西汀可能对神经元细胞突触结构有保护作用，可改善突触功能进而恢复视功能。

研究显示，ERK 通过调控CREB 参与海马神经细胞新树突棘的生成，CREB 是细胞内效应因子，参与神经元生长、突触可塑性等，其转录活性依赖于第133 位丝氨酸残基的磷酸化反应，p-CREB 可通过调节下游基因转录活性参与神经元的生长[23-24]。金霏等[25]研究显示，促进CREB 通路活化可对小鼠海马神经元突触功能发挥保护作用。本研究结果显示，模型组大鼠视皮层组织p-ERK1/2/ERK1/2、p-CREB/CREB 水平低于对照组；低、中、高剂量组大鼠视皮层组织p-ERK1/2/ERK1/2、p-CREB/CREB 水平高于模型组。提示氟西汀可能通过促进ERK/CREB 通路活化对单眼剥夺弱视大鼠视皮层神经细胞突触可塑性的恢复发挥促进作用。

综上，氟西汀能够恢复单眼剥夺弱视大鼠视皮层神经细胞突触超微结构，激活视皮层结构可塑性，可能是通过激活ERK/CREB 通路实现的。