济南市平阴县农村环境鼠形动物调查与携带病原体检测

于瑞洪,魏 凌,张 晓,李 辉,王 东

老鼠是人居环境中常见的病媒生物之一,不仅盗食粮食、污染食品、损坏物品,还会携带汉坦病毒、钩端螺旋体、巴尔通体、立克次体等多种病原体,传播多种疾病[1-3]。平阴县位于济南市西南部,地处北纬36°1′～36°23′、东经116°12′～116°37′,全县以丘陵山地为主,平原、洼地为次的地形分布特征,是国家级鼠类生态学监测点。本研究在平阴县5个乡镇农村自然村中集中开展了鼠形动物调查,并对其携带的病原体进行检测,为预防和控制鼠传疾病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 调查与鉴定 2020年11月21－30日,在平阴县玫瑰镇、东阿镇、孔村镇、安城镇和孝直镇5个乡镇的73个自然村用鼠夹法和粘鼠板法开展鼠形调查(表1),并对采集的鼠形动物进行分类鉴定[4]。

表1 鼠形动物调查村庄数与覆盖面积Tab.1 Number and coverage of villages in this survey

1.2 样本制备 将捕获的鼠形动物放在解剖盘上,用75%乙醇消毒皮肤,用无菌剪刀沿腹部正中线剪开后,取出肝、脾和肾脏器官放入冻存管中,标好编号;另换灭菌剪刀剪断胸骨两侧软肋骨,翻起胸骨,切取肺脏放入冻存管,标好编号。将存放样本的冻存管保存在－80℃超低温冰箱中,剩余鼠体高压后按实验室垃圾处理,消毒试验区域和试验用具。

1.3 鼠传致病菌检测 使用DNA提取试剂盒DNeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen,69504)和PCR检测试剂盒Taq PCR Master Mix Kit(Qiagen,201443)开展莫氏立克次体(Rickettsiamooseri)、嗜吞噬细胞无形体(Amaplasmaphagocytophilum)、恙虫病东方体(Orientiatsutusgamushi)、土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)、巴尔通体(Bartonella)和致病性钩端螺旋体(Leptospira)的检测[5-6]。等量剪取鼠肝、脾和肾组织置于同一管中混合,按照DNeasy Blood&Tissue Kit说明书提取核酸,进一步按照Taq PCR Master Mix Kit说明书配置20μL反应体系,包括10μL Taq DNA聚合酶和d NTP混合液qPCR Master Mix,0.4μL探针,0.8 μL上/下游引物(表2)和5μL DNA模板。开展实时荧光定量PCR扩增,反应条件:95℃预变性5 min,1个 循 环;95℃变 性15 s,60℃退 火45 s,45个循环。反应设阳性和空白对照,阳性对照模板为各病原的靶标序列质粒标准品。观察扩增曲线和Ct值,以Ct值≤40且有明显扩增曲线的原则判断阳性批次。

表2 鼠传致病菌引物序列Tab.2 Primer sequences for mouse borne pathogens

1.4 鼠传病毒检测 使用核酸提取或纯化试剂盒(硕世生物,SDK60104)、汉坦病毒和汉城病毒核酸检测试剂盒(硕世生物,JC60201)、新布尼亚病毒核酸检测试剂盒(硕世生物,JC70107)检测汉坦病毒(hantavirus)和发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus)[7-8]。剪取鼠肺组织或等量鼠脾、肝、肾组织研磨处理,按照核酸提取试剂盒制备RNA模板,进一步按照病毒核酸检测试剂盒说明书配置25μL反应体系,包括12.5μL 2×Reaction Mix,0.5μL上/下游引物(表3),0.3μL探针,1μL Enzyme mix和5μL RNA模板。开展实时荧光定量PCR扩增,反应条件:50℃30 min;95℃10 min;95℃15 s,60℃45 s,45个循环。反应设阳性和空白对照。观察扩增曲线和Ct值,以Ct值≤40且有明显扩增曲线的原则判断阳性批次。

表3 鼠传病毒引物序列Tab.3 Primer sequences for mouse borne viruses

1.5 数据分析计算方法如下:

组间数据资料采用SPSS 20.0统计软件进行χ2检验。检验水准α＝0.05。

2 结果

2.1 捕鼠情况与鼠种构成 共捕获鼠形动物100只,其中小家鼠数量最多,捕获55只,占捕获总数的55%;其次是褐家鼠,捕获40只,占捕获总数的40%。此外,还捕获到5只鼩鼱(表4)。

表4 鼠夹法和粘鼠板法的捕获情况Tab.4 Murine-like-animals caught in mouse clips and mouse glue traps

捕获的小家鼠、褐家鼠和鼩鼱中,粘鼠板均为主要的捕获器械,捕获率分别为85.45%、65.00%和100%。鼠夹法捕获的鼠形动物中,褐家鼠所占的比例最高,为63.64%,而粘鼠板法捕获的鼠形动物中,小家鼠所占的比例最高,为60.26%。

2.2 各乡镇的鼠密度 在平阴县玫瑰镇、东阿镇、孔村镇、安城镇和孝直镇5个乡镇17个农村自然村共布放有效鼠夹3168夹次、有效粘鼠板2351板次,分别捕获鼠形动物22只和78只,捕获率分别为0.69%和3.32%,两 者 差 异 有 统 计 学 意 义(χ2＝52.20,P＜0.001)(表5)。

表5 平阴县5个乡镇捕获情况Tab.5 Murine-like-animals caught in five towns in Pingyin county

玫瑰镇、东阿镇、孔村镇和安城镇捕鼠环境为农村居民区,2种捕鼠器械捕获率差异有统计学意义(χ2＝65.04,P＜0.001)。然而,在孝直镇的养鸡场环境中,粘鼠板法捕鼠率虽然高于鼠夹法,但两者差异无统计学意义(χ2＝2.86,P＝0.09)。

2.3 携带病原体情况 平阴县5个乡镇捕获的鼠形动物均有检出病原体,阳性率为28.00%～55.56%,平均阳性率为40.00%,各乡镇鼠形动物带毒率差异无统计学意义(χ2＝5.71,P＝0.22)(表6)。

表6 济南市平阴县各乡镇捕获鼠形动物携带病原体情况Tab.6 Pathogen detection in murine-like-animals in five towns in Pingyin County

对不同鼠形动物携带病原体的检测发现,55只小家鼠中,检出阳性23只,阳性率为41.82%;40只褐家鼠中,检出阳性14只,阳性率为35%;5只鼩鼱中,检出阳性3只,阳性率为60.00%(表7)。3种鼠形动物带毒情况差异无统计学意义(χ2＝1.33,P＝0.52)。

共检出混合感染6只,混合感染率为15.00%。其中,小家鼠4只、褐家鼠2只,混合感染率分别为17.39%和14.29%,两者之间差异无统计学意义(χ2＝0.062,P＝0.80)。混合感染均为双重感染,包括致病性钩端螺旋体与土拉弗朗西斯菌、致病性钩端螺旋体与恙虫病东方体、致病性钩端螺旋体与莫氏立克次体、致病性钩端螺旋体与巴尔通体、嗜吞噬细胞无形体与莫氏立克次体、嗜吞噬细胞无形体与土拉弗朗西斯菌,未见三重及以上多重感染。

所检测的8种病原体中,莫氏立克次体和致病性钩端螺旋体的检出率最高,均为17.00%,嗜吞噬细胞无形体、恙虫病东方体、土拉弗朗西斯菌和巴尔通体的检出率为1.00%～5.00%,并未检出汉坦病毒和发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(表7)。

表7 济南市平阴县不同鼠形动物携带病原体情况Tab.7 Pathogen detection in different species of murine-like-animals

3 讨论

平阴县属暖温带大陆性半湿润季风气候,地处泰山西延余脉与鲁西平原的过渡地带,境内形成以丘陵山地为主,平原、洼地为次的地形分布特征,适宜鼠类等小型兽类栖息繁殖。本次调查环境中的平均捕获率为1.81%,其中农村居民区的捕获率为1.54%,养殖场的捕获率为4.55%,差异有统计学意义(χ2＝23.5,P＜0.001),表明养殖场等重点场所的鼠患较为严重。捕获的鼠形动物以小家鼠和褐家鼠为主,小家鼠的比例偏高,与其他地区调查一致[9-10],这可能因为现在的农村居民住宅多为砖瓦混凝土结构限制了褐家鼠栖息。无论是对鼠种分析还是对乡镇分析,粘鼠板法的捕获率明显高于鼠夹法的捕获率,这可能与几个因素有关:1)调查季节属于秋末初冬,因室外环境较冷,鼠类转为室内活动,而粘鼠板在室内布放,鼠夹在室外布放,固粘鼠板捕获鼠类较多;2)鼠夹为一次击发,而粘鼠板可以多次粘捕,在实际调查中也经常发现粘鼠板捕获多只鼠类的现象。

平阴县5个乡镇捕获的鼠形动物中均有检出阳性,最高阳性率为55.56%,表明鼠群携带病原体的比例较高,其中莫氏立克次体和致病性钩端螺旋体感染率最高,其相应的疾病防控应加强关注。值得一提的是,捕获的5只鼩鼱感染率为60%。鼩鼱不同于鼠类,属于食虫目鼩鼱科,也经常出没于人居环境中,同样有文献报道鼩鼱携带致病病原体的情况[11-13]。

混合感染是指在同一机体检出2种或2种以上的病原体,在同一鼠体内曾报道可检出多种病原[14-16]。本研究发现6种类型的双重混合感染,以致病性钩端螺旋体与其他病原体混合感染为主,并未发现三重及以上多重感染。从鼠种上看,小家鼠和褐家鼠均发现混合感染,两者的混合感染率并没有显著性差异,而鼩鼱未出现这种情况,这可能与捕获到的鼩鼱数量太少有关,需进一步扩大调查范围和种类以确定病原体混合感染在宿主上的选择性。

综上所述,平阴县农村居民区鼠形动物不仅携带病原体,且存在两种病原体双重感染的现象,这对相应疾病的防控提出了更高的要求,除关注单一病原体的同时还需注意混合感染的可能。

利益冲突:无

引用本文格式:于瑞洪,魏凌,张晓,等.济南市平阴县农村环境鼠形动物调查与携带病原体检测[J].中国人兽共患病学报,2022,38(10):941-946.DOI:10.3969/j.issn.1002－2694.2022.00.113