上海和广东猪肉中弓形虫感染的分子流行病学调查

陈晓雨,张烨华,陆金苗,朱诗兰,蔺智兵,米荣升,龚海燕,黄 燕,陈兆国,李国清

刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)是一种重要的人兽共患病原体,可以感染几乎所有温血动物(包括哺乳动物和鸟类)[1]。人和动物主要通过摄入被猫粪污染的土壤、饮水中的卵囊,或摄入未煮熟的肉类中含有的包囊而感染,感染后可引起脑炎患者或免疫功能低下者的全身性症状,如果不加以治疗通常会致死[2]。此外,弓形虫感染还可引起反应迟钝、精神分裂、情绪失控等精神性问题[3-4]。研究发现,1990—2018年全球猪弓形虫血清阳性率约为19%,非洲最高(25%),欧洲最低(13%),亚洲约为21%[5]。我国人弓形虫的感染率约为7.9%,以隐性感染为主[6]。据报道,世界上约1/3人口呈弓形虫血清阳性[7],造成大面积感染的原因究竟何在,故开展猪肉中弓形虫携带情况的调查非常必要。

目前弓形虫感染的检测方法很多,其中以血清学试验[7-8]和分子检测方法[9]多见。此外,还可采用动物接种、组织培养和染色镜检[10]等方法。上述方法中血清学试验的重复性和灵敏度较差,易出现交叉反应;常规PCR及巢式PCR不能对样品进行定量分析,实时荧光定量PCR(qPCR)方法既可定性又可定量检查,并且特异性强、敏感性高,能检出低拷贝样本[11]。畜禽田间样品中弓形虫的含量通常比较低[12]。因此,qPCR方法非常适合对猪肉样本进行弓形虫检测。

猪肉是人类重要的肉类摄入来源,摄入携带弓形虫的猪肉是人类感染弓形虫的一个重要途径。在世界范围内已报道许多起因食用猪肉而感染弓形虫的病例[13-14]。同时,养猪场也不时报道暴发弓形虫病,给猪场造成严重损失[15]。近年来,猪肉中弓形虫的携带问题已引起人们关注。为了调查近年来上海市和广东地区猪肉样品中弓形虫的携带情况并分析其流行因素,本研究采用qPCR方法对上海和广东两地屠宰场和市场猪肉样品进行检测与分析,以便为人类和猪的弓形虫病防控提供新的资料。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 弓形虫DNA 弓形虫速殖子基因组DNA由中国农业科学院上海兽医研究所动物源性病原生物学及食品安全创新团队提供。

1.1.2 主要试剂 血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司,p MD-19T载体、Premix Ex Taq酶购自宝日医生物技术(北京)有限公司,琼脂糖购自翊圣生物科技公司,大肠杆菌DH 5α购自北京擎科生物科技有限公司,其它试剂均为国产分析纯。

1.2 方 法

1.2.1 样品采集 本研究从上海市5区(嘉定、浦东、闵行、松江和奉贤),以及广东省4市(广州、惠州、佛山和深圳)的屠宰场和市场采集猪的肌肉组织样本,每个屠宰场采集30份膈肌样本,每个菜市场(超市)采集3份腿肌样本,共1450份。每个样本约50 g,标记采样地区、屠宰场或菜市场(超市)名称、时间等信息。将样本单独放在塑料袋中,置于冷冻箱尽快运到实验室,4℃冰箱保存,2 d内处理完毕。

1.2.2 样品前处理 每份样品取3～5 g肌肉,用无菌剪刀将其剪碎,置于15 m L离心管中,离心管中装入无菌钢珠和5 m L PBS缓冲液。采用FastPrep组织快速破碎仪破碎,速度设置为6.0 m/s,持续40 s。取300μL匀浆提取基因组DNA。

1.2.3 基因组DNA提取 采用基因组DNA提取试剂盒提取猪肉组织的基因组DNA。取样品匀浆进行10000×g离心5 min,随后用蛋白酶K 56℃消化过夜,按照试剂盒说明书提取基因组DNA。提取的DNA样品置于—20℃保存备用。

1.2.4 弓形虫529 bp重复序列(repetitive 529 bp fragment,rep529)重组质粒的制备 采用本实验室建立的巢式PCR方法扩增弓形虫rep529基因。使用DNA纯化试剂盒对PCR产物进行纯化。将纯化后的PCR产物亚克隆到p MD-19T载体中,将重组质粒转入大肠杆菌DH 5α中,用巢式PCR内引物筛选阳性重组质粒,送至生工生物技术(上海)有限公司测序。测序正确的阳性质粒保存在—20℃冰箱。

1.2.5 qPCR检测 以rep529为靶基因,参考蔺智兵等[16]方法建立qPCR方法。正向引物和反向引物 分 别 为P1(5′-GCT CGC CTG TGC TTG GAG-3′)和P2(5′-ATC TTC TCC CTC TCC GAC TCT C-3′),探针为P3(FAM-TCG CTT CCC AAC CAC GCC ACC C-BHQ1),引物和探针均由上海擎科生物科技有限公司合成。总反应体积为20μL,包括10μL Premix Ex Taq(2×Conc)、0.8μL(10 μmol/L)正 向 和 反 向 引 物、0.2 μL探 针、0.2μL ROX Reference Dye、2 μL DNA模 板,最 后 用dd H2O补足至20μL。反应条件为95℃预变性30 s,95℃变性15 s,60℃退火30 s,45个循环。将1×1010copy/μL重组质粒DNA 10倍倍比稀释,采用上述反应条件,进行qPCR扩增,绘制标准曲线,检测其敏感性;以日本血吸虫、新孢子虫、巴贝斯虫、贾第虫、隐孢子虫和弓形虫DNA作为模板,检测其特异性。

1.2.6 巢式PCR检测 采用本实验室建立的巢式PCR检测方法[17],扩增猪肉样本中弓形虫ITS靶序列。

1.2.7 统计学分析 采用IBM SPSS 25.0统计软件分析上海和广东地区猪肉中弓形虫携带情况。采用卡方(χ2)检验评估各种因素对弓形虫感染的影响,检验水准α＝0.05。利用在线网站(http://www.vassarstats.net/)计算检测结果的95%置信区间。

2 结果

2.1 弓形虫qPCR检测方法的建立 以弓形虫DNA为模板,采用PCR技术扩增rep529序列,连接至p MD19-T载体,构建含有rep529序列片段的重组质粒,测序结果表明该重组质粒构建成功。对构建的重组质粒DNA进行10倍倍比稀释,共设6个梯度,每个梯度设3个重复,根据qPCR扩增结果绘制标准曲线(图1),结果表明该标准曲线R2值为0.9989,敏感性可达到1×102copies/μL。特异性试验结果表明qPCR仅扩增弓形虫DNA(图2)。

图1 实时荧光定量PCR的标准曲线Fig.1 Standard curve of real-time PCR

图2 实时荧光定量PCR特异性试验结果Fig.2 Specific detection with Real-time PCR

2.2 不同地区、不同年份猪肉样品中弓形虫携带情况 qPCR检测结果显示,在1450份猪肉样品中检出59份弓形虫阳性,检出率4.07%。其中,上海地区猪肉样本弓形虫的检出率为6.32%(50/791),广东为1.37%(9/659),上海地区的检出率显著高于广东(χ2＝20.95,P＜0.01)。不同年份中,以2018年的检出率最高,为9.29%;2019年未见阳性样品,2020年检出率为0.61%,不同年份之间检出率差异显著(表1)。

表1 不同年份猪肉中弓形虫携带情况Tab.1 Prevalence of T.gondii infection in pork by year

2.3 不同来源猪肉样品中弓形虫携带情况 检测结果显示,屠宰场猪肉的检出率为3.85%(35/908),其中上海地区为6.10%(30/492),广东地区为1.20%(5/416);市场猪肉的检出率为4.43%(24/542),其中上海地区为6.69%(20/299),广东地区为1.65%(4/243),不同来源猪肉间阳性率差异无统计学意义(χ2＝0.26,P＞0.05)(表2)。

表2 不同来源猪肉中弓形虫携带情况Tab.2 T.gondii infection in pork by source

2.4 不同检测方法检测结果比较 采用套式PCR和实时荧光定量PCR分别对上海和广东采集的884份猪肉样本进行弓形虫检测,套式PCR检出率为3.17%(28/884),qPCR检 出 率 为6.33%(56/884),2种方法检测结果差异有统计学意义(χ2＝8.91,P＜0.05)(表3)。

表3 不同检测方法检测结果比较Tab.3 Comparison of detection results of two methods

2.5 阳性样品qPCR扩增的Ct值 本次qPCR扩增的阳性样品中,Ct值大于35的占71.19%,屠宰场和市场分别 为77.14%和62.50;Ct值 在15～35的占16.95%,屠宰场和市场分别为17.14%和16.67%;Ct值小于15的占11.86%,屠宰场和市场分别为5.71%和20.83%(表4)。

表4 实时定量PCR检测猪肉样品DNA数据Tab.4 DNA data for pork samples detected with real-time PCR

3 讨论

弓形虫病是一种由刚地弓形虫速殖子、包囊和卵囊被人和动物吞食后所引起的人兽共患病,猪肉中弓形虫速殖子和包囊是重要的感染性阶段。本研究采用qPCR技术检测来自上海和广东两个地区2018－2020年的猪肉样品,比较不同地区猪肉中弓形虫的携带情况。结果显示,两地猪肉弓形虫检出率为4.07%,上海和广东地区猪肉样本弓形虫的检出率分别为6.32%和1.37%,上海的检出率显著高于广东(χ2＝20.95,P＜0.01)。不同年份中以2018年的检出率最高(9.29%),与2019(0%)和2020年(0.61%)相比差异显著。比较而言,上海地区的检出率(6.32%)低于Zhang Y等[17]使用巢式PCR对上海地区2016—2018年猪肉弓形虫流行病学调查的结果(8.3%),猪肉中弓形虫感染呈下降趋势。其原因可能与非洲猪瘟的控制有关。自2018年8月以来由于我国暴发非洲猪瘟,各大养殖场相应加强了猪场的生物安全措施[18-19],这些措施在控制非洲猪瘟的同时加强了养猪场的生物安全管理[20],降低了弓形虫感染的可能性[21]。

检测方法不同直接会影响弓形虫的检出率,尤其是在虫荷比较低的情况下。本研究对采集的884份猪肉样品同时进行巢式PCR和qPCR检测,结果显示巢式PCR对猪肉弓形虫的检出率为3.17%,而采用qPCR方法对相同样品的检出率为6.33%,2种方法的检测结果差异显著(P＜0.05)。此外,本次检出的阳性样本Ct值大于35的占71.19%,多数属于低感染状态。由此说明qPCR方法对低虫荷样本的检测效果比巢式PCR好。不过这仅是分子检测方法之间的比较,并未涉及与血清学方法如IFAT和MAT[22-24]之间的比较。本次检出的阳性样品中Ct值小于15的占11.86%,其中屠宰场和市场分别为5.71%和20.83%,差异显著。这可能是由于采样部位的不同,在屠宰场采集的是膈肌样品,而在菜市场采集的是腿肌样本。此外,市场上采集的猪肉样本还有可能在分割、运输、销售等环节受到弓形虫不同发育阶段(如速殖子和卵囊)的污染。综上所述,不同地区、不同年份、采样部位不同,以及在流行病学调查中采取的检测方法不同都会影响其调查的结果。但据以往流行病学调查结果显示,与猪的弓形虫感染最密切相关的因素是猪场的综合控制管理[25]。因此,预防弓形虫的感染首先要做好生物安全工作,这是保证猪场安全生产的重中之重。

本研究对2018—2020年上海和广东屠宰场和市场猪肉样品中弓形虫携带情况进行了分子流行病学调查,检出率(4.07%)比2016—2018年采用类似方法调查的结果稍低;2019年以来猪肉中弓形虫检出率显著下降,提示加强生物安全管理对于减少猪的弓形虫感染、提高猪肉产品质量与安全具有重要意义。

利益冲突:无

引用本文格式:陈晓雨,张烨华,陆金苗,等.上海和广东猪肉中弓形虫感染的分子流行病学调查[J].中国人兽共患病学报,2022,38(10):931-935.DOI:10.3969/j.issn.1002－2694.2022.00.132