艾司氯胺酮复合咪达唑仑对老年髋关节置换术后谵妄的影响及对HT22细胞的作用

杨子健 黄铭颖 刘湘钰 张新建，

1广州中医药大学第三临床医学院（广州 510405）；2广州中医药大学第三附属医院麻醉科（广州 510378）

术后谵妄（post operative delirium，POD）是术后1～3 d出现的急性认知功能障碍［1］，其导致的并发症严重影响患者恢复及生存质量，特别是老年人关节置换术后发病率高且目前尚无有效预防和治疗措施［2］。文献［3-4］显示术前应用亚剂量氯胺酮（ketamine，KE）或咪达唑仑（MI）可降低患者术后谵妄（POD）发生率。而艾司氯胺酮（ESKE）作为KE的旋光异构体是否具有相似作用尚无临床资料，本研究应用亚剂量ESKE复合MI麻醉前给药观察髋关节置换术患者POD的发生率，并从细胞层面观察ESKE复合MI对谷氨酸（G）诱导损伤的HT22细胞的作用并初步探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 研究对象来源研究经广州中医药大学第三附属医院伦理委员会批准（批号：2020024）。选取2021年1-7月拟行髋关节置换术的120例年龄>65岁的患者，随机分为C组（n=30）、MI组（n=30）、ESKE组（n=30）以及ESKE+MI组（n=30）。

1.1.2 纳入及排除标准纳入标准：（1）择期行单侧全髋关节置换术；（2）未合并其他严重疾病；（3）ASA分级Ⅰ～Ⅲ级；（4）精神状态正常。排除标准：（1）中途不愿继续试验；（2）术中出现大出血等严重情况；（3）术中出现严重不良反应。

1.1.3 细胞及材料HT22细胞购自上海盈湾生物公司，艾司氯胺酮溶液购于江苏恒瑞公司、咪达唑仑注射液购于江苏恩华药业公司、PBS、DMSO、G、凋亡检测试剂盒、CCK⁃8细胞活力检测试剂盒均购于北京索莱宝公司，LC5090高效液相色谱仪。

1.2 亚剂量ESKE复合MI麻醉对POD发生率的观察

1.2.1 麻醉方法常规监测各项生命体征和麻醉深度。各组于麻醉诱导前10 min给药且稀释为10 mL，ESKE组静注ESKE 0.2 mg/kg；MI组静注0.02 mg/kg MI；ESKE+MI静注ESKE 0.2 mg/kg和0.02 mg/kg MI混合液，C组给等量生理盐水。麻醉诱导：长托宁0.5 mg、舒芬太尼0.2 μg/kg、丙泊酚1.5 mg/kg、顺式阿曲库铵0.15 mg/kg。麻醉维持瑞芬太尼0.2～0.3 μg/（kg·min）、七氟烷吸入浓度1%～2%、丙泊酚4～10 mg/（kg·h），术中维持BIS 40～60。术毕应用舒芬太尼2 μg/kg、托烷司琼15 mg、酮咯酸氨丁三醇2.5 mg/kg用生理盐水稀释至100 mL自控镇痛48 h，背景剂量2 mL/h，单次按压泵注0.5 mL，锁定时间15 min。

1.2.2 检测指标记录麻醉前T0、插管时T1、手术开始时T2、手术结束时T3的平均动脉压、心率、脑电双频指数。各组患者术后24、48、72 h采用谵妄评定方法（CAM）量表判断POD发生率。评分＜19不存在谵妄、评分20～22分为可疑谵妄、评分＞22为谵妄［5］，任一时间点CAM评分＞22即记为POD发生1人次，该患者评估结束。POD组患者于谵妄发生48 h内，NPOD组于最后一次评估结束时取静脉血4 mL，用液相质谱仪检测血清谷氨酸水平。

1.3 ESKE复合MI对G诱导HT22损伤细胞作用

1.3.1 ESKE组、MI浓度筛选及G造模筛选取各组细胞，细胞浓度调整后铺板培养24 h，各组给予可达到实验浓度的ESKE（0、0.1、1、10、100、1 000 μmol/L）、MI（0、12.5、25、50 μmol/L）、G（0、2.5、5、10、20 mmol/L），12、24 h后进行CCK⁃8检测。重复3次取均值并计算筛选出ESKE、MI实验浓度和G造模浓度。

1.3.2 ESKE复合MI对G诱导损伤的HT22细胞OD值的影响将细胞分为NC组、G组、MIC组、ESKEC组、ESKEC+MIC组，24 h后除NC组外均加入20 mmol/L G造模，同时加入实验浓度的药物（MI组：MI 12.5 μmol/L、ESKE组：ESKE 100 μmol/L、ESKEC+MIC组：MI 12.5 μmol/L+ESKE 100 μmol/L），NC组加等量培养液，12、24 h后进行CCK⁃8检测。

1.3.3 ESKE复合MI对G诱导损伤的HT22细胞凋亡和坏死的影响取各组细胞培养24 h后，除NC组外均加入20 mmol/L G造模，同时各组相应处理（MI组：MI 12.5 μmol/L、ESKE组：ESKE 100 μmol/L、ESKEC+MIC组：MI 12.5 μmol/L+ESKE 100 μmol/L），NC组加等量培养液，24 h后行流式凋亡检测。

1.4 统计学方法使用GraphPad Prism 8.0.2软件分析。符合正态分布的计量资料以（）表示，组间比较采用单因素方差分析；计数资料用百分比（%）表示，采用χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料及麻醉药用量比较各组患者一般资料和血流动力学差异无统计学意义（P>0.05），各组麻醉药用量［丙泊酚（F=1.756 4，P=0.461 3）、舒芬太尼（F=0.557 4，P=0.365 3）、瑞芬太尼（F=0.791 3，P=0.675 3）、顺式阿曲库铵（F=0.491 0，P=0.489 0）］差异均无统计学意义（表1）。

表1 患者的一般资料比较Tab.1 Comparison of general data of patients ±s

表1 患者的一般资料比较Tab.1 Comparison of general data of patients ±s

一般资料年龄（岁）体质量（kg）手术时间（min）MAP T0 T1 T2 T3 HR T0 T1 T2 T3 BIS C组70.90±4.75 62.88±8.389 89.43±22.22 94.77±10.25 81.40±9.78 79.63±10.12 85.43±9.78 84.03±7.68 70.33±6.54 64.13±7.23 66.70±8.78 48.20±2.20 MI组71.95±5.34 61.25±7.64 89.45±21.25 93.25±9.85 85.45±9.36 80.25±10.25 87.36±10.24 86.21±8.23 72.06±7.14 68.65±7.54 69.76±9.12 47.30±2.40 ESKE组71.53±5.24 61.03±7.21 88.55±20.16 93.55±10.21 85.24±9.67 82.76±10.11 82.52±10.02 83.93±8.65 74.50±8.12 72.17±7.98 70.93±9.34 47.40±3.00 ESKE+MI组70.07±5.15 60.40±9.27 87.07±19.86 95.57±10.17 90.23±9.98 85.00±10.05 84.73±9.89 84.66±7.98 74.76±7.90 73.14±9.23 73.00±8.68 48.60±2.70

2.2 各组患者POD发生率比较各组间POD发生率比较，差异有统计学意义（P<0.05）；ESKE+MI组POD发生率低于C组，差异有统计学意义（χ2=7.954 1，P=0.004 2）。见表2。

表2 各组POD发生率的比较Tab.2 Comparison of postoperative delirium rate in each group例（%）

2.3 血清谷氨酸水平比较由表3可见，POD组血清G水平高于NPOD组（t=4.799，P=0.023 7）。见表3。

表3 POD与NPOD组血清G水平比较Tab.3 Comparison of serum glutamate levels between delirium and non⁃delirium groups ±s

表3 POD与NPOD组血清G水平比较Tab.3 Comparison of serum glutamate levels between delirium and non⁃delirium groups ±s

注：*P<0.05

组别POD NPOD例数28 92血清G水平（μmol/L）121.67±10.32 92.76±8.78 t值4.799 P值0.023 7

2.4 ESKE、MI的实验浓度以及G造模浓度通过浓度筛选实验，选ESKE 100 μmol/L、MI 12.5 μmol/L、G 20 mmol/L为实验浓度（图1）。2.5 ESKE复合MI对G诱导的HT22细胞OD值的影响在12 h和24 h G组OD值低于NC组（P<0.05），ESKEC和ESKEC+MIC组OD值高于G组（P<0.05，表4）。

图1 ESKE、MI及G实验浓度筛选Fig.1 Screening results of experimental concentrations of esketamine，midazolam and glutamate

表4 ESKE复合MI对G诱导的HT22细胞OD值的影响Tab.4 Effects of esketamine combined with midazolam on OD value of HT22 cells induced by glutamate ±s

表4 ESKE复合MI对G诱导的HT22细胞OD值的影响Tab.4 Effects of esketamine combined with midazolam on OD value of HT22 cells induced by glutamate ±s

注：*表示G组和NC组相比，P<0.05；#表示实验组与G组相比，P<0.05

组别NC G MIC ESKEC ESKEC+MIC F值P值12 h各组OD值1.479 1±0.156 5 0.875 5±0.059 7*0.929 7±0.073 2 0.992 7±0.080 3#1.002 1±0.076 9#15.3310<0.05 24 h各组OD值1.791 3±0.098 7 1.291 6±0.052 8*1.314 1±0.064 1 1.415 3±0.093 3#1.412 8±0.094 1#21.2970<0.05

2.6 ESKE复合MI对G诱导的HT22细胞凋亡和坏死的影响流式结果显示，Q1坏死率G组高于NC组，MIC组、ESKEC组、ESKEC+MIC组均低于G组（P<0.05）；Q2+Q4凋亡率G组高于NC组，ESKEC组、ESKEC+MIC组低于G组（P<0.05），见图2。

图2 ESKE复合MI对G诱导的HT22细胞坏死和凋亡的影响Fig.2 Effects of esketamine combined with midazolam on glutamate⁃induced necrosis and apoptosis of HT22 cells

3 讨论

POD增加老年患者术后并发症，严重影响患者的生存质量［6］。全髋关节置换术是治疗难治性退行性疾病和终末期风湿性病的重要手段［7］，但手术创伤大且术后POD发生率（4.0%～53.3%）高于其他择期手术（3.6%～28.3%）［8］。研究［9］表明麻醉用药与POD的发生密切相关，麻醉前应用MI可降低POD发生率［10］；KE是同时具有镇静和镇痛作用的麻醉药，术前给予亚剂量KE可降低POD的发生率［11］。ESKE作为KE的旋光异构体有KE镇静镇痛特点的同时具有麻醉期间快速抗抑郁等优点且副作用少［12］，因此本研究术前应用亚剂量ESKE复合MI观察老年髋关节置换术后POD的发生率，以期找到临床麻醉更加合理的用药方式。ESKE对NMDA受体和阿片u受体的亲和力是KE的2倍［13］，本研究在考虑患者年龄因素和KE亚麻醉剂量基础上，ESKE采用0.2 mg/kg亚麻醉剂量［14］。POD确认采用国内外广泛应用于老年人POD辅助诊断的CAM量表评估法，其准确性及可信度高［7］，患者术后72 h内CAM评分>22即记为发生POD。研究结果表明：ESKE复合MI诱导前给药可以降低老年患者POD发生率（P<0.05）；而单独应用ESKE或MI此效果不明显（ESKE或MI与C组比较P>0.05）。有文献［15-16］表明KE或MI单独应用均可降低POD发生率，与本研究结果不同的原因可能与手术类型、患者年龄、麻醉用药以及ESKE与KE剂量等差异有关。

文献表明围术期不良刺激导致兴奋性神经递质G在组织内含量增高诱发神经细胞损伤可能是导致老年患者POD发生的因素之一［17-19］，而本研究发现POD组患者血清G水平高于NPOD组（P<0.05），这表明POD的发生可能与G的升高有关，因此本研究从细胞层面来探索麻醉药的保护作用。HT22是小鼠海马神经元细胞系，是研究神经兴奋性损伤的优质模型，因此本研究采用G诱导损伤的HT22细胞为研究对象来观察ESKE复合MI对神经细胞的作用。NC组OD值显著高于G组（P<0.05），说明造模成功；药物处理过的ESKEC和ESKEC+MIC组OD值均高于G组（P<0.05），说明ESKE和ESKE复合MI可以减轻G对HT22细胞的损伤；流式结果中G组凋亡和坏死率高于NC组（P<0.05），说明G可以通过促进凋亡和坏死来损伤HT22细胞；ESKEC和ESKEC+MIC组坏死和凋亡率低于G组（P<0.05），说明ESKE和ESKE复合MI可以减轻G诱导的HT22细胞凋亡和坏死而发挥神经保护作用。ESKE复合MI减轻G对神经细胞损伤的脑保护作用与ESKE复合MI诱导前给药可降低老年患者POD发生率结果相吻合，据此笔者推测POD发生可能与此机制相关。减轻神经细胞损伤的脑保护作用降低POD发生率的观点与文献报道基本相同，且POD患者血清中存在多种代谢途径改变，其中包括G含量的升高［17-20］，因此本研究采用G处理的HT22细胞进行神经保护作用验证，但本课题尚需对围术期脑内G含量与POD之间的相关性进行深入研究；实验中观察ESKE对HT22细胞作用仅是为了验证神经保护作用可能与POD发生率降低相关。

总之，亚剂量ESKE复合MI麻醉前给药可降低髋关节置换术老年患者POD发生率；ESKE复合MI可通过减轻G引起的HT22细胞凋亡和坏死产生神经保护作用，ESKE复合MI降低患者POD发生率可能与此机制相关。