奶牛乳腺炎诊断方法的综合分析

王洪海，王海霞，刘丽，张作鹏

（1.大庆市农业农村社会事业服务中心，黑龙江大庆 163000；2.黑龙江职业学院，黑龙江哈尔滨 150100；3.山东省青岛市城阳区农业农村局，山东青岛 266109）

奶牛乳腺炎，又称奶牛乳房炎，是奶牛的常见病和多发病。 奶牛乳腺结构受到物理、化学或生理因素影响造成损伤，受到细菌、病毒等微生物的侵袭，引起了奶牛乳腺炎，给奶牛养殖业带来了严重的经济损失。 为此，奶牛乳腺炎诊疗和预防至关重要，文献报道的奶牛乳腺炎的诊断方法有多种，包括临床观察诊断法、体细胞计数法、理化实验诊断法、微生物培养鉴定、蛋白组学分析和基因学检测等。 本文综合分析奶牛乳腺炎诊断方法的特点，旨在选择操作方法简便、准确率高、检测成本较低的诊断方法，为快速检测奶牛乳腺炎提供了可行的技术手段。

1 临床观察诊断

奶牛临床型乳腺炎可通过观察奶牛乳房和乳汁的变化来确定。 发生临床型奶牛乳腺炎时，乳房临床诊断比较明显，出现不同程度的发红和肿胀，有的甚至乳房发生变形，乳头不对称，乳房淋巴结肿大， 触诊乳房部位可见大小不一的肿块，乳区温度具有明显差异。 临床型乳腺炎患牛乳汁色泽异常，多数呈灰色或淡黄色，有的伴有块状或絮状物，有的伴有出血，呈红色，干奶期乳腺炎有的也呈水样变化。 个别牛只也会出现体温升高、食欲减退，精神萎靡等全身症状。 临床观察仅可进行奶牛乳腺炎初步诊断。

2 体细胞计数法

奶牛乳汁中的体细胞来源牛的体细胞，主要包括分泌细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞等。 乳腺炎患牛最直接的影响是引起乳汁肿的体细胞增加， 奶牛乳腺感染病原微生物时，乳腺的免疫防御机制被激活，大量的白细胞透过乳腺和毛细血管进入乳汁，另外，因微生物感染和损伤脱落的乳腺细胞也进入到乳汁中，引起了乳汁中体细胞数量急剧增加。 正常奶牛乳中体细胞数量为2 万～20 万/毫升，超过50 万/毫升即可被诊断为奶牛乳腺炎。 体细胞计数法分为间接计数法和直接计数法。 间接法主要是通过体细胞裂解产生的凝胶或沉淀，间接计算出乳中体细胞数量，主要以加州乳腺炎检测法（CMT）和兰州乳腺炎检测法（LMT）为代表，该方法简便、快速、成本低廉。 直接计数法是利用细胞计数仪对乳中体细胞进行计数， 主要是通过仪器进行检测，目前，多数规模化奶牛场都使用奶牛生产性能测定（DHI）进行乳脂、乳蛋白和体细胞检测，用于改善饲养方式， 诊断和预防奶牛乳腺炎，该方法需要专业仪器，检测费用较高，普及程度低。

3 理化实验诊断法

主要是包括乳汁电导率、pH 值和酶活性检测。乳腺炎患牛乳中的钠、氯等离子浓度升高，钾离子浓度降低，氯化钠有导电性，乳汁的电导率提高，因此，可通过检测乳中的电导率来检测奶牛乳腺炎。 随着体细胞的大量增加，体细胞分泌的氨基葡萄糖苷酸酶和乳酸脱氢酶也随着增多，通过检测相关酶的活性也可诊断奶牛乳腺炎。奶牛乳汁正常pH 值为6.2～6.6 ， 随着乳腺中炎性反应的发生，pH 值伴随升高，呈现出碱性，为此，检测乳中pH 值也能够诊断奶牛乳腺炎。 虽然通过物理或者化学方法检测乳汁的理化性质，诊断奶牛乳腺炎，但是受到饲料配比、胎次和泌乳时间等影响，理化性质变化较大，在实际检测中应用较少。

4 微生物培养鉴定

据报道， 多数的奶牛乳腺炎发生都是由病原微生物感染引起的，引起奶牛乳腺炎的常见病原微生物有20 多种，主要包括细菌、病毒、真菌和支原体等。乳汁中病原微生物的培养鉴定是细菌性奶牛乳腺炎诊断的标准方法。主要是通过采集乳汁样品接种于适宜的培养基上，培养、染色、镜检、纯化等流程进行细菌培养，利用生化鉴定法对不同菌种进行鉴定，判定病原菌的种类。 该诊断方法工作量大、操作繁琐，检测时间比较长，通常情况需要3 天时间才能完成，容易受主观影响判断出假阳性结果。虽然现在可利用全自动细菌分析仪进行检测，但也费时费力，且成本较高。

5 蛋白组学分析

随着蛋白组学技术的发展， 又极大丰富奶牛乳腺炎的诊断技术。利用质谱和凝胶电泳方法对乳腺炎发病期的相关蛋白进行鉴定，不仅提供了新的治疗靶点，更是找了新的诊断性生物标记物。 急性期蛋白（APP）是非特异性的先天免疫物质，具有消灭感染乳腺的微生物、修复受损乳腺组织的作用。 奶牛乳腺发生炎性反应时，原本数量较低APP 的在刺激下，迅速升高，炎症消失后又恢复到正常水平。 对奶牛、山羊等反刍动物敏的急性期单位主要是结合珠蛋白（HP）和血清淀粉样蛋白A（SAA），据报道随着隐性乳腺炎加重和乳汁SCC 增加， 乳清HP 含量与SCC 呈极显著正相关；乳腺炎患牛乳中SAA 含量显著升高。因此，可利用蛋白组学技术检测、鉴定奶牛乳汁中急性期蛋白的表达情况来诊断奶牛乳腺炎。但是该方法需要较多的实验仪器，须在专业的实验室内部完成，不适合奶牛场现场进行诊断。

6 基因学检测

基于基因分析引起奶牛乳腺炎的病原微生物被学者们研究的越来越广泛，主要包括聚合酶链式反应 （PCR）、 多重PCR、 荧光定量PCR、16sRNA 基因序列测定和环介导等温扩增（LAMP）等方法检测奶牛乳腺炎。 与传统微生物培养详细，基因检测具有时间短、灵敏度高、范围广、不受抗生素影响等优点，在奶牛乳腺炎诊断方面具有广阔的应用前景。 单一PCR 和荧光定量PCR 可根据特定病原微生物设计引物， 具有准确性和敏感性， 但不能进行多种病原菌的检测， 而多重PCR 可检测多种病原菌， 具有广谱性， 但敏感程度又大大降低， 实用性不高。 而LAMP 方法弥补了PCR 的缺点， 具有检测时间短、操作简单、灵敏度高和特异性好等优点，被广泛应用于奶牛乳腺炎。 16sRNA 测序主要是依据病原菌微生物具有16sRNA 基因的结构保守性，基因大小在1500bp， 比较适中， 容易实验室检测，测序后可明确病原菌的种属，近年来，研究者利用微生物培养和16sRNA 测序相结合的方式诊断奶牛乳腺炎，取得良好的效果。 日本的Notomi 等人发明了环介导等温扩增技术（LAMP），LAMP 是在等温条件下扩增目标基因的，不需要PCR 退火变性延伸等反应阶段，程序简单，另外通过在反应体系中加入荧光染料，在直接在紫外照射下观察，反应时间仅需1 小时，缩短检测时间， 在水浴锅内可完成实验， 仪器简便。 因此，LAMP 技术操作简便，特异性强，反应时间短，适合对奶牛养殖场现场奶牛乳腺炎的主要病原微生物的检测， 减少病原菌传播和抗生素的使用，确保乳品优质、安全。