肠外致病性大肠杆菌研究

吴桐忠，张倩，张星星，钟发刚，何延华，韩猛立，黄新

（新疆农垦科学院省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室，新疆 石河子 832000）

虽然大肠杆菌（Escherichia coli）数量丰富且多数是共生的，但是仍有许多菌株具有致病性。E.coli除了作为肠道感染病原体的既定作用外，部分强毒株还会引起肠外感染。肠外致病性大肠杆菌（Extraintestinal pathogenicE.coli，ExPEC）因其数量迅速增加而对抗生素的高度耐药使其变得重要。ExPEC感染与免疫缺陷有关，主要包括年幼（新生儿）、老年、化疗或削弱免疫系统的疾病（HIV）。因此，作为一种医源性病原体，ExPEC是获得性感染的主要病原。在任意给定的时间内，每100名住院患者中，发达国家有7人，发展中国家至少有10人，每年治疗卫生保健相关感染的费用约为200亿美元［1］。

ExPEC可以引起人和动物的感染，如APEC（禽致病性大肠杆菌）、UPEC（引起尿路感染的大肠杆菌=UTI）、NMEC（引起新生儿脑膜炎的大肠杆菌）或败血症［2，3］。O2血清型E.coli是引起APEC的病原，也是引起UTI的常见病原，O18血清型E.coli可以引起禽败血症和人类新生儿脑膜炎［4，5］，UPEC通常引起败血症。人和动物菌株之间的相似性也可以在基因组水平上表征［6，7］，多位点序列分型（Multilocus sequence typing，MLST）表明众多从新生儿脑膜炎中分离出的E.coliO78血清型菌株与禽类败血症分离株归为一类。ExPEC引起动物和人感染之间的相似性，增加人畜共患病发生的可能性；而这种可能性很难证明，需要考虑到通过ExPEC污染的食品转移抗药性的可能性［8］。

在已报道的宿主特异性的病例中，似乎涉及黏附的特异性。这种特异性在人肠道E.coliO78血清型临床分离株中得到体现，产生人特异性的黏附菌毛CFA/I，并特异性与肠上皮细胞结合；同时这种特异性黏附在动物中也有显现，如从羔羊败血症中分离出P、S和F1C黏附蛋白或K99菌毛［1］，禽大肠杆菌病O78分离株编码禽特异性菌毛（AC/I菌毛，属于S-菌毛组）。

本研究将讨论ExPEC涉及的主要感染类型、毒力因子以及抵御感染的潜在手段。

1 ExPEC涉及的相关感染

1.1 禽大肠杆菌性败血症

禽大肠杆菌性败血症是家禽的重要疾病之一，给家禽养殖业造成重大的经济损失。其特点是禽类在应激条件下（如高温、高湿或轻度病毒感染即使是接种疫苗）均可引起发病。该病始于上呼吸道，细菌进入血液在体内扩散并感染重要器官，且具有很高的发病率和死亡率，部分感染（约80%）是由O1、O2和O78血清型引起的，其他血清型也可引起感染［5，9-11］。

1.2 牛羊幼畜细菌性败血症

ExPEC是引起牛羊幼畜发病的主要细菌性病原之一，导致新生幼畜败血症［12］。2015—2019年，从新疆部分（特别是石河子及周边地区）地区的发病牛羊养殖场感染的肠外组织（肺、脑、淋巴结、脾、肝等）分离出132株ExPEC，并进行了血清型、毒力、耐药性研究和综述［13，14］，表明主要血清型为O101、O154、O65；与韩和祥［15］报道的四川省规模化肉牛养殖场致犊牛腹泻大肠杆菌的血清型基本一致，与宋晓莉［16］报道的江苏省部分地区肉羊源大肠杆菌O抗原存在较大的差异；优势种系群为A和B1群，MLST分型主要为ST10、ST23和ST457。耐药性研究表明，对β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类和喹诺酮类药物耐药率较高且呈多重耐药，兽医临床较难选择有效的抗生素进行治疗和防控，有演化成超级细菌的趋势。

1.3 新生儿脑膜炎

引起新生儿脑膜炎的大肠杆菌（NMEC）主要血清型包括O1、O18、O78［17，18］，其发病率在发展中国家是千分之一，在发达国家是万分之一。

1.4 尿路感染（UTI）

ExPEC是最常见的尿路感染病原体［19，20］。2007年美国因ExPEC引起的尿路感染门诊病例约有1 000万人次，约有200万人次急诊入院［19］。年轻女性感染较多且易复发，老年患者在插入导管后也会引起感染，且尿路感染会产生后遗症，如导致肾功能衰竭及引起血液感染如败血症等［21，22］。

1.5 血液感染、败血病及脓毒症

美国每年有超过100万例的败血症病例，死亡率约30%，比美国因前列腺癌、乳腺癌和艾滋病死亡的总和还要高。脓毒症是一种威胁生命的系统性炎症，是由血液中微生物引发的［1，23，24］。

2 毒力因子

ExPEC与其他肠道菌株相比，产生外毒素并不是其主要毒力因子，ExPEC可以产生细胞毒素，但尚不清楚它们对致病性是否重要［25］。ExPEC的毒力取决于它们在宿主组织尤其是血清中的存活能力，许多与毒力相关的基因存在于大质粒上，最常见于ColV质粒［10，26］；ColV质粒是一个相关的质粒家族，编码铁摄取系统和增加基因在血清中的存活率。

ExPEC的毒力相关基因存在广泛的变异性，这类基因似乎有一个很大的“基因库”，而且它们之间有很多重叠，如铁的获取有多个遗传系统，一个Ex-PEC可以携带其中一个或多个；对编码菌毛或黏附因子基因也是如此。毒力因子是通过基因横向转移获得编码耶尔森菌素的基因，耶尔森菌铁摄取系统［10］所有的ExPEC菌株至少携带一个黏附系统，而败血症菌株至少携带一个有效的铁结合系统和血清存活基因（ISS增加血清存活率）［1］。

2.1 黏附

对宿主细胞的黏附是E.coli感染的第一步，对入侵和感染至关重要；黏附也影响宿主特异性，甚至组织特异性。因此，肠道病原体优先黏附于肠上皮，而参与UTI的细菌则黏附于膀胱上皮［27］。黏附主要取决于特定细胞器-纤毛或菌毛-识别上皮细胞的特定配体。牛、羊、猪等哺乳动物的感染始于E.coli在新生幼畜的肠道定殖，通常涉及K99和K88菌毛；AC/I菌毛仅在APEC中发现，且对鸡气管上皮具有特异性。在UTI与败血症的菌株中，最常见是结合含有α-D-Gal-1、4-β-D-Gal糖脂的P菌毛，结合b-GalNac-1、4-bGal的F1C菌毛和S-家族的菌毛；S-家族的菌毛包括SfaI、SfaII、Foc和AC/I。Sfa菌毛黏附素由败血症和新生儿脑膜炎相关菌株产生，并与含唾液酸的糖蛋白相互作用。研究表明，基因水平转移和基因重组导致S-菌毛具有不同黏附特异性，该特异性与临床症状或宿主相关。sfaAII基因（NBM菌株）与AC/I菌毛（APEC）的facA基因同源，而编码黏附的sfaIIS基因与人败血症菌株的sfaI基因同源。菌毛基因的重组增加菌毛多样性，以提高对不同宿主的适应性和抵抗宿主免疫系统的能力。ExPEC菌株表达不止一种类型的菌毛，而菌毛基因的表达似乎是协调的，对增加菌毛多样性和在不断变化环境条件下增加存活率也很重要［1］。

2.2 三型分泌系统（TTSS）

三型分泌系统是一种针状结构，用于向宿主细胞分泌效应蛋白。肠道致病性大肠杆菌（尤其是LEE系统）的TTSS已经被很好的描述。ExPEC菌株不具有LEE系统，但具有同源基因簇-ETT2=大肠杆菌三型分泌系统，类似于沙门氏菌的SPI1致病岛。它存在于人和动物养殖场的大多数EXEC菌株中［28］。然而，ETT2基因簇携带大量突变和缺失，甚至尚不清楚有多少菌株表达ETT2基因。到目前为止，还没有证据表明ETT2系统是一个分泌系统，因为没有检测到分泌蛋白［29］。然而，在大肠杆菌O157∶H7中，ETT2系统编码影响LEE基因簇中基因表达的调控因子，在禽大肠杆菌O78中，ETT2系统影响运动［30］。大肠杆菌O78-9的ETT2系统是简并的，因为它携带一个大的缺失和几个点突变。然而，它对毒力和血清抗性至关重要［10，28］。研究表明，ETT2对细胞表面具有全局性影响，并参与鞭毛和菌毛的分泌、外膜囊泡的产生和多细胞行为［31］。

3 逃避免疫反应

ExPEC菌株对含有抗体和补体的血清具有高抗性。补体复合物通过在细胞膜上形成孔来介导直接杀伤。病原体进化出抑制补体依赖性杀伤的外表面特征，如脂多糖和荚膜，这是参与血清抗性的重要因素［32］。

3.1 脂多糖

完整的脂多糖对ExPEC的血清存活和致病性至关重要。然而，由于败血症涉及大量LPS血清型，因此对于特定的血清型似乎没有优势。O-抗原链的长度也是影响血清抗性水平的重要因素之一。

3.2 荚膜

大肠杆菌产生的荚膜根据其组成和生物合成分为4类。第1、2和3组荚膜已被广泛研究，它们是由寡糖重复单元组成的酸性多糖，其在毒力中的作用已被证实［33］。第4组（也称为“O抗原荚膜”）的荚膜最近才被研究并证明有助于肠致病性大肠杆菌抵抗人α-防御素5［34］从而保护肠道内膜，肠致病性大肠杆菌三型分泌系统促进宋内志贺菌向周围器官扩散［35］。败血性大肠杆菌菌株产生荚膜多糖，对在血清中生存很重要。O78型败血症性大肠杆菌能产生O抗原荚膜（第4组荚膜），这种荚膜对血清存活至关重要［36］。在禽O78血清型ExPEC菌株中，荚膜多糖对毒力的重要作用是当一个移位阻止荚膜合成，从而导致毒力降低［37］。此外，参与第4组荚膜生物合成的etp基因精确缺失导致了血清敏感性［1］。因此，O抗原/第4组荚膜显然也是血液中细菌传播和败血症的关键毒力因子。

3.3 ISS增加血清存活率

对禽致病性大肠杆菌的研究表明ColV质粒中存在一个基因具有血清抗性，该基因称为iss，可提高血清存活率，编码一种小膜蛋白；该基因与源自λ噬菌体的E.coliK-12的bor基因同源；iss基因是血清存活的主要因素［10］；然而，尚不清楚其在血清存活中作用的分子基础。此外，从ColV质粒中删除iss基因会导致血清敏感性，并且无法与iss（bor）染色体基因互补［10］。

4 逃避营养免疫

细菌要在血清中存活，必须克服宿主的先天性免疫，主要是补体系统的作用。然而，另一个障碍是血清的营养免疫，这是由于营养素被束缚在储存分子中导致细菌无法获得，最重要的是铁的限制，铁在血液中与人类蛋白质（如铁蛋白、含铁血黄素）结合。大多数ExPEC菌株含有参与铁吸收的基因，很明显铁获取系统和受体在败血症病原体的毒性中发挥关键作用。对败血性细菌血清反应的系统分析表明，Fur基因诱导铁代谢相关基因和参与控制铁体内平衡调节［38］。多种铁获取系统的存在是必要的，但同样重要的是它们在暴露于血清时的精确调节。因此，非致病性大肠杆菌K-12即使在补体系统被热灭活的血清中生长也很差，并且其铁代谢在暴露于血清后不会被诱导［39］。此外，引入败血症菌株的Fur基因后，细菌在血清（灭活）的情况下生长得更好［39］。

功能基因组分析表明，血清暴露会改变大量的基因表达，其中大部分基因即使在缺乏活性补体的情况下也会被诱导表达［28］。因此，克服营养免疫是维持血清存活和建立血液感染的关键步骤。

5 小结

随着ExPEC危害程度的增加和研究的不断深入，必须清楚认识到ExPEC难以应对的原因。首先，肠外感染涉及大量不发生交叉反应的血清型，血清型复杂性使得包含几种菌株的简单疫苗是不可行的，目前国内尚未见相关疫苗的研究报道。此外，如果有疫苗，应该由谁接种，因为在大多数情况下感染是机会性的，通常在医疗干预后很难确定高危群体。其次，ExPEC携带多种编码抗药性的基因，通常位于易在整个细菌种群中传播的结合质粒上。此外，Ex-PEC大量存在于肠道中，在那里它们会遇到克雷伯菌和不动杆菌等，通过水平转移获得抗性基因。再者，寻找新的抗ExPEC靶标是一个真正的挑战，因为许多与发病机理有关的基因具有重叠的活性，而抑制其中之一不足以预防感染。例如，为了克服血清中铁的缺乏，ExPEC菌株编码了几种有效的铁结合系统，其中大多数是通过水平基因转移获得的；为防止血清抵抗ExPEC，有必要抑制所有铁获取系统；最后细菌进入血液，感染进程就会非常快，细菌会到达重要器官，并达到很高的数量。由于大肠杆菌脂多糖的细胞膜含有内毒素，患者即使只受到死亡细菌内毒素的威胁，也会面临严重的危险。

研发早期预警系统和确定开发药物或疫苗的新目标是当前预防ExPEC的重中之重，对预防医院和社区获得性感染患者显得尤为重要。