动物药蛋白多肽类成分抗癫痫作用及机制的研究进展

曾榕，刁丽梅

(1.广西中医药大学，广西 南宁 530001；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023)

癫痫是因脑部神经元同步异常放电所导致的慢性大脑功能失调综合征，以短暂性、反复痫性发作为特征，主要表现为认知功能障碍、运动抽搐、自主神经功能紊乱等，其与脑内兴奋性/抑制性神经递质系统失衡、神经胶质细胞功能失常、病理性神经环路建立、离子通道基因突变、神经炎症、遗传、免疫等诸多因素相关[1]。流行病学资料分析显示，全球约有7 000万的癫痫患者，活动性癫痫的患病率为(4～12)/1 000，同时每年新发癫痫的患病率为(16～51)/10 万，癫痫发病率在欠发达国家是发达国家的两倍之多[2-3]。现今癫痫的主要治疗手段以抗癫痫药物(antiepileptic drugs，AEDs)为主，尽管西医治疗癫痫疗效显著，但长期应用可存在焦虑抑郁障碍、共济失调等副作用，约有30%的患者因疗效欠佳、耐受性差而发展成为难治性癫痫(refractory status epilepticus，RSE)。而中医药治疗癫痫具有疗效稳定、毒副作用少、患者依从性高等优势，能有效控制痫性发作及延长发作间期。现代药理研究表明，动物类中药含有丰富的蛋白多肽类成分，具有抗炎、抗凝、抗惊厥、抗纤维化、改善脑组织等多方面的作用，有利于改善中枢神经系统症状[4-5]，顺应临床亟需副作用更小，效果更稳定的抗痫药物应用需求。近年来，中医药治疗越来越受到抗癫痫研究领域的广泛关注，为进一步探究中药在治疗癫痫方面的作用，本文对应用于抗痫研究的动物药中蛋白多肽类成分的作用机制进行阐述，为研发新型抗痫药物和了解癫痫的病理机制提供新的思路和方法。

1 蛋白多肽类成分的来源与作用机制

1.1 蛋白多肽类成分的来源

多肽是指100个氨基酸以下的大分子物质，既是多个氨基酸通过肽键连接而成的短链蛋白质，也是蛋白质水解的中间产物。通常10个以内氨基酸组成的肽叫做寡肽，超过10个氨基酸组成的肽称为多肽，50个以上氨基酸脱水生成的多肽为蛋白质。

天然活性多肽主要源自于各类动植物及海洋生物、微生物，目前在脊椎动物研究中最为广泛。在哺乳动物体内，肽类物质主要来自于外周脏器或中枢神经系统(central nervous system，CNS)，如生长抑素和神经肽Y(neuropeptide Y，NPY)共同参与癫痫的发病机制，NPY作为重要的神经递质调节因子可以影响CNS本身的分化与发育，并在大脑的不同部位发挥着调节作用，在海马组织内以降低神经元兴奋性为主，而在外周神经系统中常与去甲肾上腺素共存，参与心血管活动的中枢性调节过程[6]。现代药理研究表明，蛋白多肽类成分是动物药发挥独特疗效的重要物质基础，在中枢神经系统疾病中具有抗惊厥、镇静、改善脑代谢等作用[5, 7]。经化学加工后提取的多肽化合物，具有生物活性强、免疫原性低、分子质量小、选择特异性高、易于合成与修饰、不易产生耐药性等特点。此外，该成分直接来源的中药还具有易获得、毒副作用小、临床疗效确切、炮制工艺完备等优势，在抗痫新药的开发与应用中具备探索前景。

1.2 蛋白多肽类物质透过血脑屏障的作用机制

血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)由脑微血管内皮细胞、星型胶质细胞、周皮细胞、基膜紧密连接而成，是维护中枢神经系统内环境稳定的结构性和功能性屏障。该神经胶质膜的高度致密性使细胞旁转运受到限制，阻碍和控制血液中的物质进入脑组织，仅有2%的亲脂性小分子物质(分子量<500 Da)可以穿过血脑屏障到达中枢神经系统，其余98%的小分子物质和近100%的大分子均无法通过[8]。这在维持内环境的相对恒定的同时，给药物开发和靶向治疗带来极大挑战，因为药物必须首先能通过血脑屏障，并在大脑中达到一定的血药浓度方可调节相应的中枢神经系统疾病治疗靶点。而能否透过血脑屏障阻碍进入中枢神经系统受药物的分子量大小、亲水性强弱、脂溶性高低、蛋白质结合力强弱及特定电荷相互作用的影响。多肽作为内源性的生理活性物质，具有易于合成和修饰、生物兼容度高、免疫原性低、特定受体亲和度高、组织细胞间穿透力强、成本低廉等特点，仅需很少量的肽类物质就能跨越血脑屏障转运到中枢神经系统来诱发一系列的生理效应[9-10]。以这些多肽作为载体转运工具，能够以非侵入性方式将神经治疗药物输送到脑实质，降低脑损伤或神经功能障碍的风险。

大多数多肽跨越血脑屏障的机制是非饱和的跨膜扩散，其渗透程度主要取决于药物的脂溶性，如脂溶性较强的δ-促睡眠肽、阿片肽及其类似物更容易穿过血脑屏障，并具有更强的生理活性[9, 11]。如低浓度、强脂溶性的内皮-单核细胞激活多肽Ⅱ释放入脑实质，可以抑制SE大鼠脑海马区的血管生长，改善内皮细胞间的紧密连接，有利于控制急性期癫痫的发作[12]。

蛋白多肽类成分透过血脑屏障的转运机制主要包括以下几种。一是载体介导的主动转运：载体介导的转运蛋白对化学修饰结构具有高度选择性，只能转运与内源性底物具有相似分子结构和大小的药物。转运蛋白在管腔一侧识别底物，然后底物-转运蛋白结合系统触发载体蛋白自外而内的构象变化，底物顺浓度梯度输送到细胞膜的开腔侧以实现跨膜转运。但有一些小分子肽例如胰岛素、亮氨酸脑啡肽、β淀粉样多肽等，可以通过饱和转运系统来透过血脑屏障[13]。二是受体介导的细胞转运：多种蛋白质通过受体介导的内吞作用透过血脑屏障，常见的内源性受体主要有胰岛素、转铁蛋白、低密度脂蛋白等。受体介导的转运具有强烈亲和力、高度选择性及靶向特异性，在脑内皮细胞管腔侧的循环中，配体与特定的受体结合，受体-配体复合物通过囊泡运输机制到达细胞内腔，配体在溶酶体作用下从复合物中解离并释放到腔外间隙完成转运，受体则循环到内皮细胞腔内侧。这种机制的传输具有单向性、饱和性、耗能性，可以增强生物制剂在中枢神经系统的富集效应，提高血药浓度[14]。三是吸附介导的细胞转运：吸附介导转运的亲和力较低，选择性较差，但拥有更高的结合能力。多聚阳离子蛋白，或含有阳离子序列的合成肽中带正电荷的部分与脑内皮细胞表面带负电荷的部分相互作用，静电结合能力的大小决定了胞吞作用的强弱。在阿尔茨海默病中，阳离子蛋白作为配体，通过吸附铁螯合剂将其转运至脑实质中与铁离子结合，抑制脂质过氧化和蛋白质降解，有效发挥神经保护作用[15]。因此，多肽阳离子化可以促使治疗药物透过血脑屏障，增加脑内生理性摄取量。

血脑屏障/多肽/调节蛋白相互作用形成了一种脑外周组织通信手段，建立起稳定的中枢神经系统和外周循环之间传递信息分子的管道，同时这些分子物质受到生理变化的影响，在疾病状态下发生病理改变。针对这些特异性变化，研发相应的中枢神经系统性药物，能够对癫痫、脑水肿、持续神经功能障碍等神经退行性病变产生积极的治疗效果。

2 含蛋白多肽类成分动物药的抗痫作用与机制

2.1 全蝎

全蝎(Scorpion)，是钳蝎科动物东亚钳蝎的干燥全体，归肝经，具有息风镇痉、通络止痛和攻毒散结的功效，常用于治疗肝风内动、痉挛抽搐、小儿惊风等病症，是我国传统的抗痫中药材[16]。全蝎的有机活性组分构成多样，包括蝎毒、硫磺酸、棕榈酸、胆甾醇、铵盐等，其中蝎毒是蛋白质和多肽的混合物，神经毒素多肽成分含量丰富。据报道，全蝎提取物肽类能够通过抑制大脑皮层N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)结合活性，延缓戊四唑(PTZ) 诱导的癫痫小鼠模型的发作[17]。抗癫痫肽(anti-epilepsy peptide，AEP)是从蝎毒液中提取的生物活性多肽之一。该多肽由61个氨基酸残基组成，分子量为8.3kDa，属于长链抑制性神经毒素。AEP对电压门控钠离子通道具有调节作用，影响动作电位的发生[18]。AEP的分子量较小，可通过血脑屏障抑制NMDAR的过度激活，同时与25kDa突触体相关蛋白结合诱导脑组织中抑制性神经递质GABA的释放，恢复中枢神经网络的兴奋性/抑制性系统平衡，缓解癫痫的惊厥和痉挛症状[19]。现已证实，全蝎中AEP抗癫痫和预防复发的治疗效果佳，药物依赖性低，具有潜在的临床应用前景。

2.2 蜈蚣

蜈蚣(Centipede)，是蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣的干燥体，临床上可用于治疗癫痫、惊厥、抽搐等[16]。蜈蚣毒素提取液预防癫痫发作易感性可能与调控海马内脑啡肽表达来降低海马兴奋性有关[20]。蜈蚣毒素信号肽Rh Tx可激活感觉神经元痛觉受体TRPV1，引起细胞内Ca2+浓度升高，介导星形胶质细胞炎症表达，从而提高神经元兴奋性加速癫痫发作[21-22]。NTX-Ssm97成熟肽是从蜈蚣毒液中分离出来的一种选择性抑制哺乳动物Nav1.7通道的生物活性肽，可阻断外周伤害性刺激信息传入中枢，是开发镇痛、解痉药物的良好分子靶标[23]。蜈蚣多肽毒素靶向离子通道，参与调节机体多种生理或病理过程，这可能是应用于开发癫痫免疫治疗及拓宽抗炎药物选择的一种先导途径。

2.3 地龙

地龙(Earthworm)，是矩蚓科动物参环毛蚓、威廉环毛蚓等的干燥全体，具有清热止痉、平肝熄风的功效，临床常用于治疗高热神昏、惊痫抽搐、肢体麻木等症[16]。地龙中含有丰富的蛋白质和多肽，如抗微生物蛋白、钙调素结合蛋白、脂类蛋白、抗菌肽等，其中能有效发挥神经保护作用的蛋白多肽类成分质量分数不低于50%[24]。蚯蚓菌素是一种结构类似于防御素的多肽，具有神经保护和神经营养作用，能够减轻小胶质细胞介导的神经炎症反应，抑制中枢神经系统治疗药物所诱导的细胞凋亡[25]。AEDs在治疗孕妇、婴儿和幼儿的癫痫发作时，可呈剂量依赖性产生相应的神经毒性，诱导大脑发育过程中的神经细胞凋亡进而发生脑损伤，或并发认知功能障碍及智力下降[26]。故对于长期使用AEDs维持治疗的癫痫患者，设计针对不同大脑发育阶段的抗痫治疗方案，辅助中药神经保护疗法，促进脑内神经营养因子信号传递，致使疗效最大化，避免或最大限度地减少上述易受伤害年龄组的神经毒性副作用。

2.4 僵蚕

白僵蚕(Mulberry Silkworm)，是由球孢白僵菌感染的家蚕(4～5龄家蚕)干燥幼虫，含有蛋白质和多肽、脂肪酸、黄酮、甾体、多糖等多种化合物，具有显著的抗惊厥和抗癫痫作用[16]。僵蚕蛋白提取物具有两面性，既能通过抑制脂质过氧化和保护抗氧化酶，促进淀粉样β蛋白诱导的星形胶质细胞毒性沉淀，引起胶质细胞功能异常，诱导癫痫的发生发展[27]；又可通过调控γ-氨基丁酸信号通路，降低谷氨酸对神经生长因子刺激的PC12神经元样细胞模型损伤，发挥神经营养和神经保护作用[28]。经高效液相色谱法-串联质谱法分析，僵蚕蛋白酶解多肽由低于10个氨基酸组成，相对分子质量在500～1 000之间[29]，更易于透过血脑屏障阻碍进入中枢神经系统发挥抗惊厥、抗凝的药理作用。故随着对僵蚕蛋白质、多肽组分的深入研究，将其进一步应用于开发抗癫痫药物具有广阔前景。

2.5 羚羊角

羚羊角(Antelope Horn)，是牛科动物赛加羚羊的角，属于贵重中药材，主入肝经，长于平肝、息风、解痉，用于肝风内动之惊厥抽搐者，如妊娠子痫、高热痉厥、癫痫发狂等症[16]。完整的羚羊角包括角壳和骨塞两部分，羚羊角塞以水煎、浓缩和透析所得的大分子蛋白质成分 (分子量16 kDa以上, 主要为68 kDa左右) 具有一定的解热、镇痛和镇惊作用[30]，羚羊角肽主要来自于角蛋白，动物角在胃肠道极端环境下被降解后析出特异性生物活性肽，通常每个活性肽分子含有不超过20个氨基酸残基，肽的分子量越低，它们越有可能通过肠道屏障来发挥生物学作用[31-32]。蔡际群[33]在遗传性癫痫动物模型-京都震颤大鼠的海马和皮质安插电极观察其脑电波变化，发现羚羊角方可以剂量依赖性方式抑制震颤大鼠每次癫痫小发作持续时长，及减少发作次数，从而有效改善脑电图情况。与丙戊酸钠对比，停药后具有药效半衰期长，毒副作用小的优点，有利于延长痫性发作间期。因羚羊数量锐减，市场价格居高不下，现临床多使用山羊角替代，蛋白质组学研究表明二者生物活性高度相似，在胃肠道消化酶作用下释放多肽或溶解蛋白来发挥疗效[32]。对于长期需依赖药物治疗的癫痫患者而言，在保证疗效的同时又能有效缓解经济压力，并且提高濒危药用动物替代品的开发力度，对保护生物多样性具有重要意义。

2.6 麝香

麝香(Abelmusk)，是鹿科动物林麝成熟雄体香囊中的干燥分泌物，属芳香开窍药，具有通关利窍、醒脑通络的功效[16]，临床常与息风解痉药物配伍，共奏熄风化痰、开窍醒神之功来改善癫痫患者的精神状况。麝香的化学成分极其复杂，包括麝香酮及其类似物、类固醇和蛋白质。麝香中蛋白质多肽类化合物通过减少中性白细胞及其颗粒内容物的释放、抑制活性脂质成分合成、降低游离钙素水平等方式影响中性粒细胞的功能，从而发挥抗炎作用[34]。在天然麝香中可分离出有效抗炎蛋白Mu-a-1[35]，Mu阿片受体能抑制小白蛋白中间神经元末梢释放GABA ，维持海马体CA1区神经回路稳态[36]，有利于调节癫痫发作引起的免疫炎症反应。因天然麝香稀缺名贵，市售中成药多采用人工麝香，因缺乏统一的质量评估体系，临床疗效参差不齐，采用高效液相色谱法-串联质谱法分析对比天然麝香与人工麝香提取物中的胰蛋白酶多肽，发现二者含量模式存在显著差异[37]，将蛋白质作为麝香的质量评价指标，有利于开发优质天然麝香替代品制成中成药广泛应用临床。

2.7 牛黄

牛黄(Cow-Bezoar)，是牛科动物黄牛或水牛的胆囊、胆管或肝管中的结石，功善清心豁痰，凉肝熄风，开窍醒神，常用于治疗热病神昏、中风痰迷、惊痫抽搐、癫痫发狂等[16]。因本品极珍贵，现多以人工牛黄和体外培育牛黄替代品入药，胆汁酸是牛黄的主要活性成分之一，具有抗炎、抗癌、抗病毒、退热、免疫功能保护等作用，是评价牛黄及其代用品质量的重要指标[38]。AEDs丙戊酸及其活性代谢产物能通过干扰胆汁酸稳态引起肝毒性[39]，牛黄胆汁酸是一种强抗氧化剂，可能通过中止氧化应激反应来修复肝脏胆汁酸合成和转换途径，促进胆汁排泄，从而起到保护肝细胞的作用[40]，与抗痫药物协同使用可缓解其肝脏毒性。体外培育牛黄发挥抗惊厥作用可能通过保护CA3区抑制性神经递质作用，抑制苔状纤维侧支生芽，阻断异常神经回路形成，使癫痫波发放减少，脑电图评分改善，进而减少癫痫发作次数[41]。天然牛黄多用于临床急危重症，千金难求，不作为普适性药物使用，或可联合初期抗痫一线药物使用于RSE，不失为一种更安全有效的临床治疗手段。

3 小结

癫痫是世界上第二大中枢神经系统性疾病，以早期诊断不及时、药物治愈率低、易于反复发作等为诸多病患所苦。目前，癫痫的治疗以AEDs为主，起效快、药效强，但容易引起耐药性癫痫的产生，以及共济失调、焦虑抑郁障碍、肝肾功能损害等不良反应的伴生。中药治疗癫痫具有疗效稳定、毒副作用少、患者依从性高等优势，能有效控制痫性发作及延长发作间期，提高患者生活质量。虽然中药治疗癫痫起效慢，临床常需协同AEDs使用，但我国中药资源丰富，许多具有抗痫活性的蛋白多肽成分均源自于中药，以动物药居多，含量高，毒性低，具有显著的抗痫作用，其抗痫机制主要包括调节神经递质及受体、调节离子通道、抗神经元氧化损伤、调控炎症因子及凋亡相关基因的表达等多重途径。而蛋白多肽类成分因为易于合成和修饰、生物兼容度高、免疫原性低、特定受体亲和度高、组织细胞间穿透力强、成本低廉、性能安全、稳定等特点，能够通过血脑屏障/多肽/调节蛋白相互作用形成一种脑外周组织联系管路，将治疗药物高度富集于脑实质内，调控相应的中枢神经系统疾病治疗靶点，目前在治疗中枢神经系统疾病中受到广泛关注。因此，随着多肽技术、中药炮制工艺等现代生物技术的研究与发展，从中药中开发具有抗痫活性的蛋白多肽类成分用于治疗癫痫有良好的前景，能为癫痫的临床诊断与治疗提供有力的佐助。

目前针对动物药蛋白多肽类成分的研究也存在一些问题，考虑其成分复杂，仅有少量能够被完全分离纯化并确定氨基酸序列，空间结构解析不足，且蛋白多肽类成分多为亲水性大分子，由于胃肠道不稳定、渗透性低、血清半衰期短等，直接口服生物利用度不足，难以达到临床起效标准。故从动物药中提取该类成分作为治疗性多肽，提高生物口服利用度具有一定的研究潜力。临床中多以中药复方或中药复方联合AEDs治疗癫痫，少以单药起效。中药复方具有多成分、多靶点、多通路的综合药理作用，大部分中药动物药与诸药配伍后经过煎煮、浓缩，最终制成相应的汤药或中成药来发挥功效，其是否会改变动物药中蛋白多肽类成分的主要起效方式，从而影响最终的治疗效果值得深究，故需要有特定的研究方法和手段去探索动物药中如蛋白多肽类成分、小分子化合物等发挥疗效的重要物质基础，以期解决中药动物药在临床使用及推广中的科学问题。