嵌合抗原受体T淋巴细胞免疫疗法在原发性肝癌中的应用

李康伟， 尉 丁， 张若涵， 李 霄， 陶开山

1 第四军医大学 a.研究生院， b.基础医学院细胞生物学教研室， 西安 710032；2 第四军医大学西京医院 肝胆胰脾外科， 西安 710032

原发性肝癌根据病理分型可划分为肝细胞癌(HCC)、肝内胆管癌以及混合型肝癌。其中HCC约占原发性肝癌的90%[1]，已经成为全球恶性肿瘤相关死亡的第四大原因[2]。在我国，肝炎相关肝硬化是HCC常见的发病原因，且大多数患者在就诊时肿瘤已发生转移[3]，此时患者无法满足手术治疗指征，丧失了最佳治疗时机。

大部分HCC患者需要接受综合性治疗，如手术切除、微波消融、肝动脉灌注化疗栓塞术、放疗、化疗和肿瘤靶向药物治疗。肝移植仅限用于少部分患者，且肝源短缺。目前，外科手术仍是可切除肝癌最优先的治疗方案，然而肝癌术后5年复发患者高达70%～80%[4]，其他常规治疗策略往往不能达到令人满意的疗效。联合索拉非尼、瑞戈非尼行靶向治疗，部分患者也仅能增加短短数月的总生存期[5]。因此，迫切需要新的、有效的治疗方案应用于HCC治疗。随着免疫治疗的发展，目前较具有研究前景的是嵌合抗原受体T淋巴细胞(chimeric antigen receptor T cell, CAR-T)免疫疗法。

1 CAR-T免疫疗法概述

肿瘤免疫治疗领域在过去的几十年中取得了飞速的进步，肿瘤免疫治疗主要包括单克隆抗体、免疫检查点抑制剂、细胞疫苗和过继性T淋巴细胞疗法等[6]。CAR-T为过继性T淋巴细胞疗法之一，是一种颇具研究潜力且已经取得临床突破的免疫疗法，其基本原理是将患者的T淋巴细胞通过基因转导技术获得能够识别特定抗原的特异性T淋巴细胞，再重新回输到患者体内，与肿瘤相关表面抗原结合，并激活免疫反应从而破坏肿瘤细胞[7]。

CAR-T免疫疗法融合了抗体对抗原的高特异性与T淋巴细胞杀伤靶肿瘤的细胞毒性这两种优点[8]。其基本构造分为3个部分：胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和促进细胞因子分泌的胞内信号结构域。CAR-T免疫疗法至今已发展到第五代。第1代因其在体内增殖，能力较差，抗肿瘤能力存在很大的局限性。随后研究人员在胞内段引入协同共刺激分子增加CAR-T的抗肿瘤效果，加入1个共刺激分子称为第2代。第3代加入2个协同共刺激分子，显著提升CAR-T的抗肿瘤作用。第4代增加了新的细胞因子序列，使CAR-T能够在病灶区域分泌增强抗肿瘤免疫反应的细胞因子[9]。第5代CAR-T在此基础上增加了细胞因子受体的胞内段序列，被用来诱导细胞因子信号，进一步促进细胞增殖，作用更加持久[10]。CAR-T识别特定抗原信号后激活并杀伤肿瘤细胞，激活后CAR-T可在体内复制增殖以产生较为持久的疗效，并释放具有趋化作用的细胞因子引起其他免疫细胞聚集共同杀伤肿瘤细胞。2017年10月，全球首个CD19 CAR-T正式批准应用于治疗成人弥漫大B细胞淋巴瘤，临床研究[11]结果显示，接受治疗12个月后，疾病无复发率为64%，存活率达到79%。在血液系统恶性肿瘤取得较好疗效的同时，实体肿瘤的临床试验也在陆续开展。

2 CAR-T免疫疗法在原发性肝癌治疗中的应用

目前，临床试验[12]数据已证实CAR-T免疫疗法具有良好的抗肿瘤效应。CAR-T可以直接杀伤肿瘤细胞，而裂解的肿瘤细胞碎片与肿瘤相关抗原可发挥免疫激活剂的作用正向调节机体免疫细胞对肿瘤的杀伤作用。由于同时具有细胞免疫和体液免疫的优点，CAR-T可能成为原发性肝癌治疗的一种有效手段[13]。在我国，CAR-T免疫疗法逐渐成为临床研究热点。2017年，我国超过美国成为CAR-T免疫疗法临床试验数量第一的国家[14]。根据ClinicalTrial.gov数据，截至2021年底，全球肝癌CAR-T研究项目48项，我国有32项(67%)。

Wang等[15]开展的一项CD133-CAR-T研究，共入组23例晚期恶性肿瘤受试者，包括HCC受试者14例，其中2例肿瘤低负荷(肿瘤直径<5 cm)的HCC受试者获得了最长的疾病稳定持续时间，分别为13.7个月和15.2个月；HCC受试者的中位无进展生存期为7个月；3个月疾病控制率为64%，6个月疾病控制率为43%。另一项靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)CAR-T治疗HCC的 Ⅰ 期临床试验[16]结果显示：患者6、24和36个月的总生存率分别为50.3%、42.0%和10.5%。本研究中心开展的一项CD147-CAR-T的Ⅰ期临床试验中，最低剂量组(8×106个CAR-T细胞)的3例患者治疗后肿瘤病灶缩小，肿瘤标志物水平下降，较高剂量组(24×106个CAR-T细胞)目前仍在进行观察，期待获得更好的疗效。国际上其他针对HCC的CAR-T临床试验也取得了一些成果，但仍面临部分需要解决的问题[17]。

3 CAR-T免疫疗法在原发性肝癌治疗中面临的困难与问题

CAR-T免疫疗法在实体瘤治疗中主要未解决的难点在于肿瘤部位浸润不良和T淋巴细胞抑制[18]，通过趋化因子受体改善T淋巴细胞的运输是提高CAR-T发挥作用的可靠方法[19]，解决肿瘤部位浸润不良和T淋巴细胞抑制是CAR-T治疗实体瘤获得成功的突破口。

3.1 缺乏肿瘤特异性抗原 靶抗原的选择是CAR-T免疫疗法应用于原发性肝癌治疗首先面临的难题，肿瘤靶抗原应在肿瘤细胞特异性表达，而在身体重要器官不表达，减少对人体正常组织产生的毒副作用。AFP、CEA、GPC-3、MUC-1、CD133、CD147等通常在HCC中过度表达，而在正常组织中表达水平很低，是潜在的治疗靶点[20-22]。其中，CD147也被称为细胞外基质金属蛋白酶诱导剂，是一种高表达于癌细胞的跨膜糖蛋白，在原发性肝癌患者中阳性率高达80%，与肝癌细胞的集体侵袭有关[23]，并且与患者总生存率呈负相关[24]，可作为肿瘤治疗的靶点。一般情况下，表达高水平靶抗原的肿瘤细胞会被CAR-T优先清除，而表达靶抗原水平较高的正常组织细胞亦会受到攻击。为减少对正常组织的损伤，特异性识别肿瘤细胞，Chen等[25]报道了一种针对HCC靶向双抗原的CAR-T，只有同时表达GPC-3和ASGR1(一种肝组织特异性蛋白)2种抗原的肿瘤细胞才可以被识别，进而激活CAR-T杀伤肿瘤细胞。这些靶向双抗原的CAR-T不会识别单独表达单一抗原的正常组织，从而使杀伤作用更加精确，降低了因误伤人体正常组织引起不良反应的风险，但这可能导致表达单一靶向抗原的肿瘤细胞逃逸。Tang等[26]使用溶瘤病毒将肿瘤靶点特异性导入肿瘤细胞，使靶抗原阴性的肿瘤细胞表达靶抗原，减少肿瘤细胞的逃逸现象。另一方面，溶瘤病毒对癌细胞的直接裂解作用导致肿瘤相关抗原释放，CAR-T和溶瘤病毒的结合可以增加CAR-T运输，提高抗肿瘤作用以及消除抗原阴性肿瘤细胞。

3.2 CAR-T对肿瘤组织的浸润性差 CAR-T向肿瘤中浸润和驻留在实体瘤中起着重要的作用，但肿瘤相关成纤维细胞和异常的血管形成了致密的物理屏障，这种物理屏障和肝脏免疫抑制环境导致CAR-T较难渗入肿瘤组织[27]。Adachi等[28]研究认为，部分趋化因子(IL-7等)可以显著促进CAR-T浸润到肿瘤组织，也可以通过肿瘤动脉局部给药的方式增加CAR-T在肿瘤组织中的驻留，能够获得比静脉给药更好的抗肿瘤效果。巨噬细胞在肿瘤微环境中是浸润率最高的免疫细胞，Chen等[29]试图利用CAR修饰的巨噬细胞对抗实体瘤，然而巨噬细胞难以在体内增殖，疗效有限。另外有学者[30]设想设计一种可同时杀伤成纤维细胞的CAR-T，降解纤维结缔组织，以促进CAR-T浸润。

3.3 肿瘤微环境抑制CAR-T活性 与其他实体肿瘤一样，CAR-T在肝癌组织中的生长增殖远不及血液系统肿瘤。原发性肝癌肿瘤组织由肿瘤细胞和基质细胞组成(成纤维细胞、肿瘤相关巨噬细胞等)，伴随迂曲畸形的血管和致密的纤维结缔组织，细胞过度的有氧酵解和血液灌注不良造成肿瘤微环境的基本特点是缺氧和低pH值[31]。Meng等[32]证实酸性条件可以通过上调HCC组织中受体酪氨酸激酶样孤儿受体1的表达，显著促进癌细胞的迁徙，而碳酸氢钠治疗可以改善肿瘤组织的低pH值，从而减少肿瘤转移。此外，我国HCC往往建立在慢性炎症的基础之上，患者由肝炎进展为肝硬化再转变为肝癌，因此肿瘤和潜在的慢性肝脏炎症共同塑造了肿瘤细胞生长的微环境。此外，肝肿瘤中存在的免疫抑制细胞(如功能失调的调节性T淋巴细胞和肝星状细胞)抑制T淋巴细胞增殖和自然杀伤细胞活性，保护肿瘤逃避免疫攻击。肝肿瘤通过肿瘤微环境诱导的免疫抑制机制逃避免疫反应[33-34]，在肝肿瘤发生和发展过程中占重要地位，并且与肿瘤复发密切相关。在这种微环境中，CAR-T存活困难，难以达到理想的杀伤肿瘤效果。改善低氧、低pH的肿瘤微环境并联合使用抗病毒药物可有效提高CAR-T杀伤肿瘤的疗效。

4 CAR-T免疫疗法的安全性

CAR-T免疫疗法相关的2种最常见的不良反应为细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome,CRS)和神经毒性综合征(neurotoxicity syndrome,NT)。

CRS是由CAR-T释放大量细胞因子(IFNγ、IL等)和趋化因子(CCL2、CXCL8等)而引起的炎症反应[35]。输注CAR-T后，T淋巴细胞迅速扩增，从而产生与巨噬细胞激活相关的炎症状态，随后多种细胞因子水平升高(IL-6、IFNγ等)，导致内皮激活、血管内凝血、血脑屏障通透性增加以及脑膜炎症[36]。CRS表现为全身症状，如发热、寒战、全身疼痛，可迅速进展为呼吸急促、缺氧、低血压、心率加快、毛细血管渗漏、休克，其首发症状通常为发热[37]。对于发热等非特异性全身症状，主要是对症支持治疗，即应用退热药和补液。Hariri等[38]认为白蛋白对CRS患者更有效，因为其可以降低毛细血管渗漏和肺水肿的风险。对于严重的CRS(以发热、缺氧和升压药维持血压为特征)，通常采用托珠单抗注射液(一种抗IL-6抗体)进行治疗。

CRS的治疗和管理已逐步完善，但对NT的研究和治疗仍在探索中。Mackall等[39]研究发现，由炎症和细胞因子增加引起的血脑屏障破坏是NT发生的关键启动因素。NT可能表现为谵妄、脑病、失语、嗜睡、注意力不集中、激动、震颤、癫痫发作，以及罕见的脑水肿[40]，严重CRS和NT风险增加的患者建议应用大剂量皮质类固醇(地塞米松、甲泼尼龙)治疗[41]。上述2种常见的不良反应在给予对症支持治疗后可缓解，仅少数患者会发生严重不良反应[42]，临床中发现，相较于血液系统肿瘤的CAR-T治疗，实体瘤CAR-T治疗的不良反应发生率相对较低，为实体瘤CAR-T临床试验的顺利开展提供了保障。

5 小结与展望

CAR-T免疫疗法对肝癌等实体恶性肿瘤的治疗尚处于大量临床试验阶段，目前已经取得了一定的成果。缺乏特异性抗原靶点、肿瘤微环境抑制、CAR-T在肝癌组织中浸润性差是CAR-T免疫疗法应用于肝癌治疗的主要障碍。此外，其安全性以及副作用也是需要关注的问题，但各种实体肿瘤的第一阶段数据表明，CAR-T治疗较为安全，毒副作用可控。相信随着CAR-T免疫疗法的不断改进和完善，将取得更好的疗效。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：李康伟起草并撰写文章主要内容；尉丁负责协助补充文献并完善文章内容；张若涵负责主要内容修改；李霄协助文章修改及审校；陶开山指导文章思路并修改了文章关键内容。