氨氧化微生物及其应用于土壤污染生态毒性研究进展

高燕春张亚男王明明牟勇霖刘爱菊

(1.淄博市数字农业农村发展中心，山东 淄博 255000;2.淄博市农业环境暨农产品质量监督检测中心，山东 淄博 255000；3.山东理工大学资源与环境工程学院，山东 淄博 255049)

随着社会经济的发展，人类生产过程中产生的各种污染物通过不同途径进入土壤环境，并逐渐超过土壤自净能力，最终使土壤质量与功能发生变化，产生土壤污染问题。土壤污染按污染物种类可区分为无机污染、有机污染以及复合污染。2014年全国土壤污染状况调查发现，无机污染物超标点位数占全部超标点位的82.8%，其中以Cd、Zn、As、Cu等污染最为严重[1]。土壤有机污染则是以农药、抗生素、多环芳烃等污染为主。随着社会经济的发展，土壤重金属污染与有机物复合污染已成为危及生态系统稳定、农产品质量和人体健康的主要环境问题。

土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，在推动土壤养分转化，能量流动等方面具有重要作用，并且土壤微生物对土壤环境的变化极为敏感，可以作为指示土壤污染的敏感受体。多种终点指标可以被用来指示重金属对土壤微生物群落的效应，如土壤生物量、土壤呼吸、酶活性、硝化作用和固氮等。如何选择有效的终点指标用来开展土壤污染对土壤微生物群落毒性的评价，则是一个需要反复验证的课题。土壤中氨氧化作用不仅是硝化作用的第1个反应步骤，也是限速步骤，是全球氮循环的中心环节。推动氨氧化作用的氨氧化微生物，因其对重金属污染的敏感性以及在各种环境中的广泛分布，在指示土壤污染对微生物活性影响方面具有广泛的应用前景。随着人们对土壤生态功能健康与安全的日益关注，以及微生物研究手段的不断创新，将氨氧化微生物应用于土壤污染生态风险分析与评估研究受到了国内外学者的重视。

1 土壤氨氧化微生物的生态作用及其检测技术

氮素的生物地球化学循环主要由固氮作用、硝化作用、反硝化作用和氨化作用组成。其中，硝化过程分为2个阶段，氨氧化为亚硝酸，称为亚硝化反应(即氨氧化反应)，由氨氧化菌(细菌AOB和古菌AOA)完成；亚硝酸氧化为硝酸，称为硝化反应(即亚硝酸氧化反应)，由硝酸盐细菌完成。

最初的土壤微生物研究发现，氨氧化微生物在自然界中广泛分布于各种生态系统中，并在地球氮循环中起着至关重要的作用。Cabcllo等研究氮循环的过程，证明AOA和AOB在硝化作用过程中起着重要的作用[2]。进一步的研究确定了氨氧化微生物参与氨氧化反应的作用机制。氨氧化菌将氨氧化生成亚硝酸盐的过程主要分为2个反应步骤，氨在氨单加氧酶(AMO)的催化下被氧化成羟胺，再由羟胺氧化还原酶(HAO)催化氧化生成亚硝酸盐。由于土壤中NH3的浓度很低，底物不足导致氨氧化速率缓慢，使氨氧化作用成为硝化作用中的速度控制步骤，同时在地球氮循环中起着关键的调控作用。此外，该生物过程对重金属、有机物污染较为敏感，所以对氨氧化微生物功能基因的定性、定量分析可以说明污染物对土壤微生物的毒性作用。近几年氨氧化微生物作为理想的模式微生物在土壤污染生态毒理效应研究中受到广泛关注。

目前关于土壤中氨氧化微生物的分析，常用的检测分析手段有潜在硝化势、脲酶含量等，还有基于DNA方法的群落分析如聚合酶链式反应(PCR)技术、荧光原位杂交(FISH)技术、限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)技术、变性梯度凝胶电泳(DGGE)/温度梯度凝胶电泳(TGGE)技术等分子生物学技术的应用。

已有的研究表明，PCR、FISH、测序等技术能够对自然环境微生物的目的基因进行研究，T-RFLP技术的应用为研究微生物群落的时空分布提供了技术支持，对氨氧化微生物的深入研究有利于了解微生物参与的氮形态转化，也是今后全球氮循环的重要研究方向。

2 氨氧化微生物对典型环境因子的响应

土壤微生物通常会对环境因子的变化表现出一定的适应性，然而，氨氧化细菌和氨氧化古菌对环境干扰具有较强的敏感性。因此，探究环境因子(底物浓度、温度和pH等)对氨氧化微生物的影响已成为近些年硝化作用研究的重点。研究表明，温度通过影响土壤中pH和含水量等理化性质和氨氧化微生物的酶活性，间接或直接影响氨氧化微生物的相对丰度和群落结构，且AOA更能适应极端温度环境[3]。土壤溶液的pH可以直接影响氨氧化作用的底物氨分子的存在形态，进而影响氨氧化微生物活性和群落结构。在中碱性土壤氨氧化作用主要由AOB主导[4]；而在低pH土壤中，AOB的数量相对较少活性较低，证明AOA主导酸性土壤中的硝化作用[5]。国内外不同土壤条件下的研究都发现AOA的存在，因此学者推测AOA分布范围广泛并在极端环境中主导氨氧化作用。

上述研究表明，氨氧化微生物分布广泛，对生态因子较为敏感。但是在进行土壤污染微生物生态毒性效应研究时，必须考虑去除其它生态因子的干扰作用。因此，收集不同自然环境下氨氧化微生物的自然波动范围，可对污染胁迫下的氨氧化微生物响应机制及土壤污染生态效应定量描述提供更准确数据。随着近年来微生物基因表达“正常操作范围(Normal Operating Range)”理论的不断成熟，将土壤NOR值引入土壤污染生态毒性效应的评估极大推动了土壤微生物对生态因子胁迫响应的定量描述研究。

3 污染土壤中氨氧化微生物研究进展

近年来土壤中单一污染和复合污染日趋严重，土壤污染的生态毒性效应也引起了研究者的广泛关注。氨氧化微生物作为参与硝化过程的重要微生物，对土壤环境中的单一及复合污染存在良好的剂量效应关系，对其功能基因(amoA)的丰度和多样性进行深入研究，可为探索污染胁迫下土壤氨氧化微生物群落动态及分布提供直接证据，以达到预测土壤环境变化和进行土壤环境管理的最终目的。

3.1 土壤中氨氧化微生物对无机污染物的响应

无机污染中以重金属污染最为突出，因为重金属广泛存在于土壤环境中且易于积累，虽然微量重金属是微生物生长代谢所必需的，但若超过一定浓度，则对微生物具有一定的毒害作用。土壤中氨氧化微生物对外界环境的变化与重金属污染非常敏感，是反映土壤重金属污染的微生物指标。

已有的研究证实，氨氧化微生物活性与重金属之间存在良好的剂量效应关系，低浓度的Cd增强氨氧化微生物活性，从而提高土壤中硝化速率，增加硝态氮含量；高浓度的Cd抑制氨氧化微生物，减缓硝化作用，降低了土壤硝态氮含量[6]。而Ruyters等利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术对amoA基因进行测定，分析氨氧化微生物的群落结构变化，发现AOB对重金属更为敏感，AOA对重金属锌和铜的耐受性较高，硝化菌群对重金属Zn和Cu耐受性的增强与土壤污染的程度一致，证明amoA基因转录水平的变化可以作为土壤重金属污染生态毒性效应的指标[7]。近年来研究也表明，基于amoA基因的丰度和多样性检测可以揭示高浓度重金属胁迫下氨氧化微生物群落受到严重抑制，并可反映长期低剂量重金属暴露状态下AOA和AOB的丰度和种群结构会发生显著变化。

3.2 土壤中氨氧化微生物对有机污染物的响应

目前，土壤中典型的有机污染物主要为有机农药、多氯联苯(PCBs)、多环芳烃(PAHs)及抗生素，而且有机污染物对硝化作用的影响已有一些报道，但从微生物层面进行的研究较少。目前已知酸性土壤中的杀虫剂明显抑制硝化作用，甲胺磷能使土壤硝化作用减弱。杨玲等对除虫菊酯类、有机磷类、有机氯类、氨基甲酸酯类、酞胺类等9种农药进行了研究，试验结果表明，9种常见农药在不同情况下硝化势均有不同程度的下降[8]。农药长期污染则会造成土壤中氨化细菌、氨氧化细菌、硝化细菌数量增加，反硝化细菌数量减少，氨化作用和硝化作用强度也随之得到增强，说明氨氧化微生物在指示土壤有机污染的生态毒性效应方面存在良好应用前景[9]。多氯联苯(PCBs)是首批被《斯德哥尔摩公约》列入全球控制的持久性有机污染物(POPs)之一，易与有机质结合，造成持久污染。长期PCBs污染使土壤硝化势显著降低，硝化作用受到显著抑制。多环芳烃(PAHs)指具有2个或2个以上苯环的一类有机化合物，包括萘、蒽、菲、芘等150余种化合物，是一种典型的土壤有机污染。早期研究发现，土壤菲污染与硝化势之间有良好的剂量效应关系。Sverdrup等学者证实氨氧化速率对PAHs污染最为敏感，利用氨氧化速率的变化可以很好地表征土壤中PAHs[10]。进行土壤微生物分析发现，中等浓度(70～100μg·g-1)的芘可以严重影响氨氧化微生物的活性，且EC50值随着处理时间的延长而增大[11]。因此，利用氨氧化微生物个体活性和群落多样性进行农药、多氯联苯和多环芳烃污染的毒性效应研究具有一定的可行性。

抗生素在土壤环境中浓度较低，且由于抗生素多为抗微生物药物，在长期低水平暴露的情况下，能直接杀死环境中某些微生物或抑制其生长，威胁环境中微生物的种类、数量和群落结构，对其生态功能造成严重影响。探究土壤微生物对抗生素的响应机制成为国内外学者研究重点。国内研究发现，恩诺沙星和土霉素在低浓度(0.01mg·kg-1和0.1mg·kg-1)时可刺激土壤硝化作用，但在浓度为1mg·kg-1时对土壤硝化作用产生抑制，而在浓度为10mg·kg-1时，强烈抑制土壤硝化作用，其中土壤硝化势明显受到高浓度土霉素的抑制，抑制率可达20%[12]。磺胺类抗生素低剂量施用则对土壤硝化细菌、亚硝化细菌、反硝化细菌及氨化细菌均存在激活作用，对硝化细菌的最大激活率可达1000%以上[13]。不同种类抗生素的抗菌机制可能是不同种类抗生素对土壤硝化作用影响呈现出不同特点的一个重要因素。已有研究采用基因水平分析得出土壤硝化微生物的群落功能多样性随土霉素浓度升高显著降低的结论。探究氨氧化微生物对抗生素的响应机制不仅为土壤修复提供重要理论支持，还可完善土壤有机污染的生态风险评价，但目前相关研究仅局限于单一土壤污染，有机污染物常与其它污染物联合作用使其毒性增强，因此对复合污染下土壤微生物的响应机理仍需进一步探索。

3.3 土壤中氨氧化微生物对复合污染物的响应

土壤复合污染通常定义为2种或2种以上的污染物在土壤中同时存在，并且每种污染物的浓度均超过国家土壤环境质量标准或已经达到影响土壤环境质量水平的土壤污染。对复合污染条件下，微生物对污染胁迫的反应机制进行研究更反映实际情况。如，重金属Cd、Pb复合污染对土壤硝化作用的影响存在明显交互现象，Cd起主导作用，表现为低质量分数的有效态Cd对脲酶活性具有促进作用，而较高质量分数的有效Cd表现为抑制作用，其原因可能是重金属通过抑制土壤硝化微生物的生长和繁殖，减少体内酶的合成和分泌，最后导致土壤酶活性下降[14]。国外学者以不同程度多环芳烃(PAHs)和重金属污染的土壤作为研究对象，结果显示，复合污染中菲对不同土壤样品的氨氧化微生物活性的影响差别很大，其中无污染土壤中微生物活性明显高于污染土壤；出现这种现象的原因可能是土壤原有的污染物与菲相互作用的结果，增强了菲的毒性。上述研究结果表明，土壤复合污染种类繁多、作用机制复杂，土壤微生物对土壤复合污染的响应机制有待于进一步研究。

土壤抗生素与重金属复合污染更为普遍，作用机制也更为复杂。四环素与铜的复合污染中，铜在土壤硝化过程中起主要作用，土壤硝化速率与Cu2+浓度显著负相关，且铜在一定程度上可减缓四环素的毒性；这与四环素具有电子提供基团易与铜等二价金属离子发生配位反应有关[15]。基因水平分析表明，恩诺沙星和镉的复合污染对AOB-amoA基因数量的影响大于对AOA-amoA基因数量的影响，恩诺沙星对氨氧化细菌的影响随着其浓度的增加，抑制作用越明显，复合作用的抑制强度明显大于单一污染处理组[16]。进一步研究表明，土霉素、恩诺沙星和磺胺二甲嘧啶，这3种抗生素和Cu的单一及复合污染与氨氧化微生物amoA基因拷贝数之间存在明显的剂量-效应关系：复合污染对AOB和AOA的毒性作用随抗生素浓度变化而变化，其毒性强弱顺序也随之发生不同程度的变化，具体交互作用类型的变化有待研究[17]。由此可见，氨氧化微生物活性和群落结构变化可作为复合污染的预警指标，同时探究土壤微生物对复合污染的响应机制为实际修复工作提供了新的思路。

4 结论与展望

理想的生物指标应该具有可定量、敏感、特异和易于测定的特点。硝化速率对重金属毒性比其它微生物指标更为敏感，而且可定量，易于测定，但是因硝化速率的测定受土壤环境因子的影响较大，不适合作为单一的终点指标来指示土壤污染状况。氨氧化菌的功能基因amoA的变化可以明显反映硝化活性的变化。通过定量PCR amoA基因的测定，确定环境中氨氧化细菌的种群大小和群落结构变化，可以说明污染物对环境微生物的毒性作用。近期研究表明，氨氧化微生物amoA mRNA水平对氨氧化活性的变化非常敏感，可以作为土壤中氨氧化活性的生物指标。硝化速率与这些指标结合在一起，可以更全面准确地确定污染物对土壤的生态毒性水平信息。

到目前为止，氨氧化微生物在土壤重金属污染的毒性评价中具有的作用己经毋庸置疑，而对氨氧化作用及采用氨氧化微生物各种生理特征为指标对土壤复合污染进行的研究并不是很多，随着微生物在土壤污染毒性评价越来越受到人们的重视，这方面的研究也有很多需要开展的工作。