汉麻内生菌的研究进展

吴琼 王雷 曹涤非 李瑶 孙尧 孙鑫 薛佳莹 黄国庆

(黑龙江省科学院高技术研究院，黑龙江 哈尔滨 150020)

汉麻又名大麻，人类很早就将其作为纺织纤维原料使用。由于汉麻纤维拥有天然的抗菌及消毒作用，研究发现，麻类织物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有天然的抗菌抑菌性能，汉麻叶对多种细菌和真菌具有抑制作用。汉麻制品有其它材质产品不能代替的特殊功效。对汉麻纤维研究的同时，发现汉麻同其它天然产物一样，含有黄酮、多酚、多糖、生物碱等活性成分，这些成分具有抗炎症、抗氧化、抑菌、免疫调节、防晒等广泛的药理活性，具有很高的药用价值。所以，汉麻作为服用天然抗菌纤维材料极具开发和应用前景。

1 汉麻内生菌的研究意义

在我国，生物农药一般指在农业生产实际应用中可以进行大规模的工业化生产的微生物源农药。生物农药的出现及发展经历了曲折的过程，与生物防治研究的发展和化学农药的使用息息相关。1853年，Agostino bassi首次报道了由白僵菌引起的一种家蚕传染性病害“白僵病”，证实了白僵菌能够在家蚕幼虫体内生长和发育，如通过接种、接触或污染饲料的方式传播发病；1879年，俄国的梅契尼可夫为防治小麦金龟子幼虫应用绿僵菌；1901年，日本的石渡从家蚕中分离得到一种叫苏云金芽孢杆菌的致病芽孢杆菌；G B fanford于1926年使用拮抗体防治马铃薯的疮痂病。

受不同宿主植物种类和外在环境影响，植物内生菌的种类和数量差异很大。不同植物其体内菌种不同，同种植物在不同地点、温度或环境下其菌种不同，即使同一植物在不同的时间，菌种也会不同。这一特点使得内生菌菌种更加多种多样。19世纪首次出现内生菌一词，Vogl在100多年前就从黑麦草种子中分离得到了内生菌，但由于内生菌的生长环境十分独特，人们一直忽视其的存在。到了1993年，美国学者分离短叶紫衫树皮的内生菌次级代谢物得到紫杉醇和紫杉烷类化合物，至此之后，人们开始关注到药用植物内生菌的研究。作为一种微生物新资源，植物内生菌有菌种易于选育、代谢易于控制、生长周期短且可通过大规模发酵来实现工业化生产等优点，人们对其日益关注，从中找寻活性成分渐渐成为研究的热点。研究汉麻组织中分离出的内生真菌，并对其进行分类组学和次生代谢产物的研究，可以扩充汉麻内生真菌的种群资源。当前，国内外对汉麻的研究主要集中在汉麻育种、纤维纺织、军需装备、油脂、药物、汉麻籽营养组成及功效等，并没有利用汉麻内生菌及其提取物制备生物源农药的报道。因此，开发汉麻内生菌，寻找新的抗生素具有广阔的前景。

汉麻是桑科属一年生草本植物，英文名Hemp，世界各地均有栽培。麻仁润滑肠道，通便，雌花和叶止咳定喘，解痉止痛。大麻纤维具有抗菌、除臭的作用，根据国内外有关研究报告，汉麻纤维制品对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌等有明显的杀灭、抑制作用。大麻是多种生物活性化合物的来源，如大麻素、萜烯和酚类化合物具有抗菌作用，抗真菌、抗炎和抗癌特性。大麻作物生长无需任何化学物质，自身既可抵御各种病虫害，是典型的绿色环保作物，更是一种天然的抑菌剂。这些主要来源于汉麻内生菌产生的次级代谢产物。

2 汉麻次生代谢产物的生产途径

2.1 直接从汉麻中提取次生代谢产物

由于次生代谢产物在植物中含量一般较低，在栽培过程中不易控制各种影响因素，有效成分含量较低低，品种品质不稳定，将投入大量人力、物力及财力等。研究汉麻内生菌使其易于选育、代谢更易于控制、生长周期短，且可通过大规模发酵来实现工业化生产等优点。天然活性物质的重要来源是植物内生菌与其宿主植物共同生长与共同进化的相互作用过程。在这个过程中，可产生具有与宿主植物活性成分相同或相似的生物活性的代谢产物和次生代谢产物。还有一些生物活性成分与宿主植物完全不同，这些成为天然活性物质的重要来源。

2.2 化学合成模拟

在完全了解植物体外次生代谢产物的反应步骤的前提下，利用化学工业手段，可对次生代谢产物进行完全合成或半化学合成。但是化学合成的方法会遇到一些问题，如成本高、收率低、毒性大。汉麻中活性物质种类繁多，如黄酮、萜类、生物碱及酚类物质，这些物质成分的某些化合物可以产生同分异构体，使操作工艺流程复杂及环境污染严重等。汉麻中大麻酚类成分具有一定的抑菌作用，Giovanni A等研究发现，具有不同结构的大麻酚的抑菌性差异显著，其中对金黄色葡萄球菌抑菌性较强的是含有异戊二羟基的大麻酚。

2.3 微生物(细菌或真菌)发酵

微生物的生命力非常旺盛，具有惊人的繁殖速度，一个繁殖周期可能只需要短短几十分钟，且分布广泛。Strobel等于1993年从短叶红豆杉的韧皮部中分离得到一株能生产紫杉醇内生真菌Taxomyces and reanae，自此以后，利用植物内生真菌发酵法获得与宿主相同或相似的次生代谢产物已成为科学家们研究的热点。

3 国内外研究进展

21世纪以来，人们的环保意识在不断增强，微生物源农药，因其较高的环境相容性受到了广泛的重视，其主要分为活体微生物农药及代谢产物农药2种[1]。内生真菌与菌根真菌类似，能够赋予植物优良的生长性状，并且能增强宿主植物抗逆性，此特性是内生真菌成为新的研究热点的重要原因之一[2]。内生真菌能够提高植物的抗逆性主要表现在以下2个方面：非生物胁迫，包括抗高温、抗旱等，以往的研究显示，正常条件下，感染内生真菌的黑麦草体内的保护酶系统，如过氧化物酶、超氧化物酶等的活性明显比未感染内生真菌的植株高，由此可以得出，内生真菌可能提高了植物的超氧化物酶活性的调节能力，从而提高植株的抗旱性[3]，另外，有些真菌能通过分泌糖类物质或在植物表面形成菌膜来进行协同抗旱；生物胁迫，包括抵抗病虫害、阻抑昆虫和食草动物的采食等，植物受内生真菌感染能够产生多种生物碱，致使植物害虫虫体重量下降、幼虫的生长发育速度减慢、繁殖能力下降、发育历期延长、死亡率上升、吸引害虫天敌及对害虫产生驱避作用[4]，进而使植物拥有更高的抗虫能力，是植物生物防治病虫害的新研究思路[5]。综合以往研究来看，关于内生菌提高宿主植物抗逆性的作用机制相关研究报道较少，并且研究结论多为间接的或者推论性的[6]。

1998年，根据加拿大受管制药物和物质法，工业大麻作为大田作物开始商业种植[7]。2009年，汉麻的种子和纤维用于多工业用途，如油、外用软膏、服装纤维、家庭建筑材料、制造电动汽车零部件[8]。自加拿大合法化以来，工业用地总面积达到3200～44000hm2，大麻产量稳步增长[9]。2011年，45种工业大麻被加拿大卫生部授权THC低于0.3%，这些品种一般都是谷物或多用途，种子和茎都找到了终端市场[10]。McPartland等在2000年发现，在大麻的成长阶段不易受病虫的侵害[11]。2008年隽美玲等报道了汉麻叶75%乙醇提取物对大肠杆菌没有抑制作用，而对金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌作用；同年，崔广东对汉麻叶75%乙醇提取物的石油醚浸膏对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌有显著的抑制作用。2011年杜军强等对汉麻叶75%乙醇提取物研究发现，汉麻叶对须癣毛癣菌、红色毛癣菌、犬小孢子菌等具有显著抑制作用。2012年Muhammad研究发现，大麻叶提取物具有杀根结线虫且促进植物生长的作用[12]。2013年Gautam等发现，药用野生大麻中含有内生真菌和细菌有益于其相关的寄主植物生长[13]。

汉麻的植物化学成分和汉麻的品种没有过多关联，汉麻易受许多植物病原体的影响，如根瘤菌、根腐病和根腐病致病因子，但在汉麻所有成长阶段几乎不易致病。因此，汉麻内生菌产生的次生代谢产物能够防止汉麻植物病原体的影响。微生物内生菌是有益的植物共生菌，这些有益菌对汉麻植物组织和器官没有造成伤害或表现出明显的症状，并已经被证明通过产生植物激素来帮助植物生长，增加分可用性等[14]。2017年Malhadas研究发现，汉麻通过其生产具有生物活性的次生代谢产物的能力来保护植物免受疾病和非生物因素的影响[15]。2018年Chakraborty发现，汉麻叶75%乙醇提取物对金黄色葡萄球菌表现出良好的抑制作用。

汉麻中内生菌的发现为筛选具有抑菌活性的内生菌奠定了理论基础。其往往会产生新颖的抗生素活性成分，并且为了避免宿主组织的死亡，这些抗生素活性成分的毒性相对较低。因此，开发汉麻内生菌，寻找新的抗生素的相关研究具有广阔的前景。