全外显子组测序法鉴定中国Ⅰ型Stickler综合征一家系致病基因

邓芳 曹迎杰 谢丽静 陈少婉 肖小强 张铭志

汕头大学·香港中文大学联合汕头国际眼科中心，汕头 515041

Stickler综合征是一种遗传性结缔组织病，主要与编码胶原蛋白的基因突变有关。COL2A1、COL11A1和COL11A2致病性变异引起的Stickler综合征以常染色体显性方式遗传；COL9A1、COL9A2和COL9A3致病性变异引起的Stickler综合征以常染色体隐性方式遗传[1-2]。胶原蛋白是软骨细胞外基质、眼和内耳的重要组成部分，是软骨内骨形成、生长及维持关节、视力、听力正常功能的必要成分[3]，因此胶原蛋白合成障碍主要影响眼、耳、关节和中线面部结构，表现为眼部损害(高度近视、玻璃体变性、白内障、周边视网膜变性、孔源性视网膜脱离)、神经性听力丧失、关节异常、中线面部结构异常(鼻梁凹陷、小颌畸形、腭裂、悬雍垂裂)[4-5]。目前已发现并确诊为Stickler综合征的患者中，绝大多数是由于COL2A1基因突变引起的[6-8]。由于胶原蛋白在多个组织中均有表达，胶原蛋白合成障碍所引起的临床表现较多、复杂且难以鉴别，针对其导致的损害，特别是孔源性视网膜脱离，目前尚缺少特异且有效的治疗方法。故发现并确认Stickler综合征致病基因突变，认识更多的病理特征能够促进该病的及时诊断及多样式治疗方法的探索，提高患者的生活质量。全外显子测序(whole exome sequencing，WES)已被广泛用于遗传性疾病研究中，极大提高了变异基因的检测效率。本研究拟通过WES鉴定Ⅰ型Stickler综合征一家系COL2A1基因的致病突变位点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

采用家系调查研究方法，收集2012年6月在汕头国际眼科中心就诊的来自中国潮汕地区的汉族Ⅰ型Stickler综合征一家系共4代39人及正常对照200人，详细询问并记录该家系家族史，家系中已故成员病历资料由其子女提供。本研究遵循《赫尔辛基宣言》，研究方案经汕头国际眼科中心伦理委员会批准[批文号：EC20110310(2)-P02]，患者及其家属均对本研究目的知情并自愿签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1临床检查 对患者Ⅳ-4、Ⅲ-5、Ⅲ-6和Ⅳ-9进行视力、裂隙灯显微镜、眼压和彩色眼底照相检查。

1.2.2样本采集及DNA提取 采集该家系5例患者和4名表型正常者外周静脉血各5 ml，提取DNA，置于EDTA抗凝管中，采用DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)，按照说明书提取基因组DNA。采用Nanodrop 1000(美国Thermo公司)对提取基因组DNA的浓度和纯度进行测定，-20 ℃分装保存。

1.2.3WES及潜在致病突变筛选 患者Ⅲ-5基因组DNA样本由北京安诺优达公司进行WES。采用Agilent Sure Select All Human Exon v5.0试剂盒(美国Agilent Technologies,Santa Clara公司)对2 μg DNA样本进行文库构建和外显子捕获。文库构建完成后基于HiSeq 2500PE100平台(美国Illumina公司)，利用双末端测序法对DNA进行测序。测序原始数据，进一步将WES分析数据通过比对软件BWAMEM与人类基因组(h919)进行比对。采用samtools、bcflools软件对单核苷酸多态性和插入/缺失变异进行检测，数据分析按以下步骤进行筛选：(1)保留外显子区域以及剪切位点变异；(2)剔除同义变异；(3)保留不在ExAC数据库的突变或等位基因频率<0.01的突变；(4)筛选已报道的COL2A1致病突变；(5)通过SIFT、Polyphen2、MutationTaster预测保留有害突变；(6)通过显性遗传模式筛选COL2A1。

1.2.4Sanger测序验证和共分离验证 采用Primer 3在线设计PCR引物，由广州艾基生物公司合成，COL2A1正向引物序列：5'-CCCTTGGCTTCAGACCCT-3'，反向引物序列：5'-CCCCTGTCACAA TTCTCAAAATT-3'。利用BioRad PCR仪进行PCR扩增，单一的PCR产物进行Sanger测序。根据5例受检患者和4名表型正常者及正常对照者血液基因组Sanger测序结果进行变异位点家系共分离分析。

图1 Ⅰ型Stickler综合征家系图 □：正常男性；○：正常女性；■：男性患者；●：女性患者；/：已故；:外显子测序样本；*：抽取血液样本；：先证者；:盲成员Figure 1 Pedigree of a family with Stickler syndrome type I □:normal male;○:normal female;■:male patient;●:female patient;/:deceased;:WES sequencing sample;*:peripheral blood sample collected;:proband;:blind

1.2.5氨基酸保守性及蛋白质三维结构分析 采用氨基酸多序列比对及UniProt结构域预测对变异位点进行氨基酸保守性分析及蛋白质三维结构分析。

2 结果

2.1 家系患者临床表现

该家系4代共39人，其中15例患者，24名表型正常者，符合常染色体显性遗传方式(图1)。先证者Ⅳ-4就诊时7岁，入院查体右眼高度近视，裸眼视力为数指/眼前，矫正视力不提高，眼压10 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，视网膜脱离、斜视；左眼盲，眼压6 mmHg。右眼行视网膜脱离复位联合硅油填充术后1年裸眼视力恢复至0.1，眼压33.1 mmHg(考虑为术后继发性青光眼)；左眼眼压测不出(图2)。患者Ⅲ-5右眼高度近视、白内障，左眼眼球萎缩；患者Ⅲ-6右眼葡萄肿、知觉性外斜视，左眼视神经萎缩。患者Ⅳ-9双眼高度近视，右眼-17.00 D，左眼-18.00 D。该家系其余患者具有类似先证者的临床表现，临床表现符合Stickler综合征。

图2 先证者Ⅳ-4彩色眼底照相 A：术前右眼视网膜灰白色隆起，9：00位疑见卵圆形裂孔 B：右眼行视网膜脱离复位联合硅油填充术后视网膜复位，眼底豹纹状，杯盘比约为0.9Figure 2 Fundus images of the proband Ⅳ-4 A:Before surgery,a gray-white retinal bulge with a suspected oval hiatus at 9：00 was seen in right eye B:After retinal detachment repair combined silicone oil tamponade,tigroid fundus was observed,and the cup to disc ratio was 0.9 approximately

2.2 WES及潜在致病突变筛选

将WES检测到的所有突变基因进行逐步比对筛选，筛选得到COL2A1基因杂合子突变位点c.1693C>T:p.565Arg>Cys。通过SIFT、Polyphen2、MutationTaster预测分析为有害性突变，符合Ⅰ型Stickler综合征的诊断。

2.3 Sanger测序验证基因突变及家系内共分离分析

该家系5例受检患者血液基因组中存在该变异位点，表型正常者及对照者未检测到该变异位点，符合家系共分离(图3)。

图3 Sanger测序峰图验证突变 箭头所示为突变位点Figure 3 Variant confirmation by Sanger sequencing The arrow showed the mutation site

2.4 氨基酸保守性及蛋白质三维结构分析

通过对多个物种的COL2A1蛋白氨基酸序列比对分析表明，COL2A1蛋白氨基酸序列第565位精氨酸(Arg，R)在人、小鼠、大鼠、牛、非洲爪蟾中高度保守(图4A)，COL2A1蛋白的第565位精氨酸突变为半胱氨酸，此氨基酸位于该基因的三螺旋功能结构域(图4B)，此突变使蛋白质在三螺旋重复区域Gly-X-Y发生变化，X位置的精氨酸残基变为半胱氨酸残基，影响纤维蛋白功能，从而产生致病性。

图4 COL2A1蛋白的多氨基酸序列比对及蛋白结构示意图 A：多序列比对对不同物种中COL2A1蛋白的突变p.Arg565及附近区域氨基酸残基的保守性分析 B：COL2A1蛋白二级结构模式图 Ⅱ型胶原蛋白α链共有1 487个氨基酸，分为4个功能域，蓝色代表VWFC结构域，紫色代表三螺旋结构域(第565位氨基酸由精氨酸突变为半胱氨酸)，黄色代表C-末端胶原结构域，绿色代表非胶原结构域Figure 4 Multiple alignment of COL2A1 protein amino acid sequences and COL2A1 protein structure A:Cross-species conservation of the protein COL2A1 around the mutation,p.Arg565,amino acid residue B:COL2A1 protein secondary structure Collagen type Ⅱ α chain contained 1 478 amino acids,4 functional domains.Blue represented VWFC domain.Purple represented trihelix domain (an arginine to cysteine substitution at position 565).Yellow represented C-terminal collagen region.Green represented non-collagenous region

3 讨论

Stickler综合征常见的眼部临床表现包括高度近视、玻璃体变性、白内障、周边视网膜变性、孔源性视网膜脱离等；其他系统表现包括神经性听力丧失、低年龄时期关节活动度高、退行性关节病、脊椎骨骨骺发育不良，鼻梁凹陷、小颌畸形、腭裂、悬雍垂裂等。这些表现在儿童期更为突出，随年龄增长表现不明显。值得注意的是，并不是所有Stickler综合征患者都有高度近视，且与其他原因引起的近视，如发生在青少年中的近视有所不同，Stickler综合征患者通常表现为先天性近视、度数较稳定、高度近视[5]。该家系眼部特征符合Stickler综合征常见临床表现，4例患者中有3例是高度近视，且年幼发病(Ⅳ-4为7岁，Ⅳ-9为5岁)，2例有视网膜病变。该家系在外院被诊断为Stickler综合征，后于我院对家系成员进行病史采集、部分眼科检查及绘制家系图。此诊断尚存在缺陷，缺少该家系于外院就诊的临床资料，未进行颌面部、骨骼及关节的临床检查及听力测试，虽然不影响本研究结果，但也使研究资料的完整性受到一定影响。本研究采用WES方法进行基因分析，鉴定了该家系的致病基因COL2A1突变，确定该家系为Ⅰ型Stickler综合征。

编码Ⅱ型胶原蛋白的COL2A1，Ⅺ型胶原蛋白的COL11A1、COL11A2以及Ⅸ型胶原蛋白的COL9A1、COL9A2突变分别导致I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型Stickler综合征[6-8]。COL2A1和COL11A1主要在玻璃体中表达，前者突变导致Ⅰ型玻璃体表型(玻璃体凝胶残迹位于紧贴晶状体后面的空间，且有一层皱褶的膜为后界，也称为“膜型”)；后者突变可导致Ⅱ型玻璃体表型(玻璃体液化，不规则增生的纤维索条，也称为“念珠型”)[5-6]；COL11A2不在眼部表达，故其突变引起的Stickler综合征缺乏眼部异常表现；COL9A1突变引起玻璃体进展性液化，形成光学玻璃体空洞；COL9A2突变引起的表型与Ⅰ型、Ⅱ型类似[6-8]。COL2A1共有54个外显子，除外显子3、5、22、24、31、37、54截至目前尚未发现有致病突变外，绝大多数外显子均发现有致病突变[9-31]，少数致病突变发生在内含子[10,14-15,29,32]；外显子2(对应VWFC结构域)[9,15,17,28]及外显子23[9-10,15,28,30-31]、42[9-10,15]、51[9-10,14-15,23](这3个外显子均位于三螺旋结构域)突变碱基数量较多，分别至少有8种不同类型的突变，可能为突变热点区域，其余外显子则分布较均匀；碱基突变类型166种，135种发生在三螺旋结构域；在氨基酸突变种类中，甘氨酸和精氨酸突变频率较高，可能为突变热点氨基酸；多个氨基酸插入突变类型均发生在内含子区。已确定的玻璃体表型绝大部分对应氨基酸框移突变类型。本研究所涉及的COL2A1突变位点为已知突变，已被国外报道的2例均为散发病例。散发病例MS12与本家系患者Ⅳ-4眼部临床特征一致，均有视网膜脱离、高度近视以及斜视；散发病例MS16和本家系患者Ⅲ-5均有高度近视、视网膜脱离、白内障；除Ⅲ-5患有非Stickler综合征眼部特征眼球萎缩外，从眼部临床表现来看未发现有明显不同。本研究突变位点与第365位精氨酸突变为半胱氨酸所产生的效应及临床表现一致[10]。此突变在中国人群中首次报道，证实了此基因突变不是人种特异性的突变。

本研究通过绘制家系图、收集病史、眼科检查及WES鉴定出Ⅰ型Stickler综合征一家系的致病突变COL2A1基因c.1693C>T，该变异位点首次在国内报道。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明邓芳：设计试验、实施研究、采集数据、文章撰写和修改；曹迎杰、陈少婉：数据分析；谢丽静：收集病例、实施研究、解释数据；肖小强：设计试验、指导试验、文章智力性内容的修改及定稿；张铭志：设计试验、指导试验