常染色体隐性遗传增强蓝视锥细胞综合征中国汉族一家系临床和遗传学特征分析

蒋永强 陈慷 李杰 郭浩轶

河南省人民医院眼科 河南省立眼科医院 河南省眼科研究所，郑州 450003

增强蓝视锥细胞综合征(enhanced S-cone syndrome，ESCS)又称蓝锥细胞增强症，是一种少见的常染色体隐性遗传性视网膜疾病，通常由感光细胞特异表达的核受体转录因子(nuclear receptor subfamily 2,group E,member 3，NR2E3)基因突变造成[1]。ESCS患者临床表现为夜盲、高度远视、调节性内斜视、黄斑区视网膜劈裂、视网膜电图(eletroretinogram，ERG)明视反应以S视锥细胞介导的大振幅波为主等。Marmor等[2]于1990年首次报道8例ESCS患者，目前国内未见相关病例报道。本研究采用全外显子组测序(whole exome sequencing，WES)对中国汉族可疑ESCS一家系进行基因检测，确定该家系的致病突变位点并分析患者临床表型，为ESCS的临床诊断提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

采用家系调查研究方法，纳入2021年6—9月在河南省立眼科医院就诊的中国汉族ESCS一家系，收集该家系成员3代6人的临床资料，包括5位表型正常成员和1例患者。同期纳入60名在河南省立眼科医院体检的健康受试者作为正常对照，正常对照均排除眼部及全身疾病。本研究遵循《赫尔辛基宣言》，研究方案经河南省立眼科医院伦理委员会审核批准[批文号：HNEECKY-2017(6)]，所有受检者均了解本研究目的并自愿签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1家系成员临床检查 详细询问并记录家族史、婚育史及全身其他疾病史。对家系中患者及表型正常成员进行眼部检查。采用对数视力表测定受检者裸眼视力和最佳矫正视力；采用角膜映光法检查双眼斜视度；采用同视机检查双眼斜视度和眼外肌功能；采用裂隙灯显微镜检查眼前节；采用双目间接检眼镜检查眼底；采用全景眼底照相仪(英国欧堡公司)检查受检者视网膜自发荧光；采用Octopus视野计(瑞士Haag-Streit集团)检查视野；采用光相干断层扫描仪v1.33.1[中国视微影像(河南)科技有限公司]检查受检眼黄斑部结构；采用眼科激光眼底血管造影机(德国海德堡公司)进行受检眼荧光素眼底血管造影(fluorescein fundus angiography，FFA)检查；采用RETIport视觉电生理系统(德国Roland公司)记录全视野ERG。按照国际临床视觉电生理协会2015年公布的记录标准化方案，依次进行暗适应的4项检查：(1)暗适应0.01 ERG，光刺激强度为0.01 (cd·s)/m2；(2)暗适应3.0 ERG，光刺激强度为3.0 (cd·s)/m2；(3)暗适应3.0振荡电位，光刺激强度为3.0 (cd·s)/m2；(4)暗适应10.0 ERG，光刺激强度为10.0 (cd·s)/m2。明适应10 min后，行明适应的2项检查：(1)明适应3.0 ERG，光刺激强度为3.0 (cd·s)/m2；(2)明适应3.0闪烁ERG，光刺激强度为3.0 (cd·s)/m2；全部测试由同一医生进行。对混合光反应的a、b波，明视ERG a、b波和30 Hz闪烁光ERG反应波形进行分析；采用RETIport视觉电生理系统记录受检眼多焦视网膜电图(multifocal eletroretinogram，mfERG)，使用61个六边形刺激，每个循环47 s，分析各环对应视网膜区域的N1和P1波平均振幅密度。

1.2.2家系致病基因的WES检测 对先证者及其胞兄、父亲、外公、舅舅进行WES检测，重点分析与视网膜疾病及眼球发育相关基因。

1.2.2.1基因组DNA提取 采集受检者外周静脉血各5 ml，采用磁珠法血液基因组DNA提取试剂盒(北京Tiangen Biotech公司)提取基因组DNA，采用Qubit 3.0荧光计(Qubit双链DNA检测试剂盒，美国Invitrogen公司)定量基因组DNA的质量浓度及总量(质量浓度≥50 ng/μl，A260/280为1.8～2.0，DNA总量≥6 g)。采用琼脂糖凝胶电泳检测提取基因组DNA的纯度及完整性。

1.2.2.2基因组文库构建 采用Covaris M220 Focused-ultrasonicator对质检合格的基因组DNA样本进行片段化回收处理，采用Integrated DNA Technologies(美国IDT公司)的xGen®Exome Research Panel v2.0试剂盒对人类全基因外显子组区域进行液相捕获建库。

1.2.2.3WES及Sanger测序验证 将捕获的DNA文库通过Illumina HiseqX测序平台(美国Illumina公司)对人类全基因外显子组序列进行2×150 bp的双末端测序，获得原始测序数据。质控原始数据，合格后将结果通过Burrows Wheeler Aligner(BWA version 0.7.16a，http://bio-bwa.sourceforge.net/)软件与UCSC人类基因组参考序列GRCh38进行比对，生成的bam文件采用Genome Analysis Tool Kit(GATK，version 4.0.8.1)软件进行变异检测分析，主要包括单核苷酸多态性、插入和缺失等，根据测序深度和变异质量进行变异过滤(变异Quality除以Depth的比值，即QD值需大于2，变异位点深度至少达到20X)，最后利用ANNOVAR(http://annovar.openbioinformatics.org/)软件进行变异位点注释，获得候选致病突变位点，筛选出的所有候选致病突变位点经Sanger验证以排除假阳性，并在家系成员中验证是否与临床表型共分离，最终确定致病基因突变位点。

1.2.3变异位点致病性及保守性分析 采用SIFT、Polyphen2、MutationTaster在线工具分析变异位点有害性；采用美国医学遗传学及基因组学会(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)遗传变异分类标准与指南分析变异位点致病性；采用SIFT分析变异位点对应氨基酸序列保守性。

2 结果

2.1 该ESCS家系临床特点分析

该家系符合常染色体隐性遗传方式(图1)。先证者Ⅲ-1，21岁，以自幼夜盲、视近时眼球内斜、视疲劳为主诉就诊；验光结果示右眼+4.50 DS-0.75 DC×5°=0.7，左眼+5.00 DS-1.25DC×175°=0.3；双眼斜视度为0～+10°；交替遮盖内-正(图2)。

图1 ESCS家系图 □：正常男性；○：正常女性；：男性携带者；●：女性患者；/：已故；：先证者Figure 1 Pedigree of the ESCS family □:normal male;○:normal female;:male carrier;●:female patient;/:deceased;:proband

双眼球运动检查示右眼下斜肌轻度亢进，上斜肌功能轻度减弱；双眼隐性水平性眼球震颤；双眼前节检查未见明显异常，双眼视盘边界清，色泽正常，周边视网膜可见色素样沉积，黄斑区上方血管弓处出现淡黄色病灶，视网膜色素上皮缺损(图3)；双眼血管弓内黄斑区自发荧光增强(图4)；OCT检查可见黄斑区外丛状层视网膜层间出现低反光小腔，呈虫噬样(图5)；FFA检查显示视网膜血管及视盘形态正常，黄斑区未见荧光素渗漏(图6)；双眼视野检查显示环形暗点和旁中心暗点(图7)；ERG表现为暗适应下低强度光(0.01)刺激记录不到波形，高强度光(3.0)刺激记录到大而慢的反应波，随背景光强度增加(明适应)，该波形无变化，暗适应曲线的视锥细胞反应曲线之后不出现视杆细胞反应曲线，30 Hz条件下呈非常小且延迟的波形(图8)；mfERG显示1环N1和P1波振幅密度轻度下降、波形相对正常，随离心度增加潜伏期延迟；mfERG二维图显示左眼中心峰向颞侧偏移，呈旁中心注视(图9)。先证者母亲Ⅱ-2因脑出血于2018年去世，去世前眼部情况正常；先证者胞兄Ⅲ-2和Ⅲ-3(25岁、28岁)、父亲Ⅱ-3(52岁)、外祖父Ⅰ-1(78岁)及舅舅Ⅱ-1(56岁)双眼眼位正常，眼底检查和全视野ERG均未发现明显异常。该家系符合家系共分离。

图4 先证者双眼眼底自发荧光图像 双眼血管弓内黄斑区可见强荧光 A：右眼 B：左眼Figure 4 Fundus autofluorescence images of the proband Strong fluorescence was seen in the macular area within the vascular arch in both eyes A:right eye B:left eye

图5 先证者双眼黄斑OCT图像 黄斑区近外丛状层视网膜层间出现密集的不规整低反射小腔 A：右眼 B：左眼Figure 5 OCT images of the proband Dense irregular hyporeflective cavities were seen between retinal layers near the macular outer plexiform layer A:right eye B:left eye

图6 先证者双眼FFA图像 双眼颞上方血管弓可见斑片状弱荧光(箭头)，后期无明显增强，黄斑区未见荧光素渗漏 A、B：右眼 C、D：左眼Figure 6 FFA images of the proband Patchy weak fluorescence (arrow) was seen in the superior temporal beyond the vascular arch in both eyes,not significantly enhanced in the late stage,and no fluorescein leakage was found in the macula A,B:right eye C,D:left eye

2.2 该ESCS家系基因检测结果分析

先证者NR2E3基因存在1个复合杂合变异，为5号外显子c.671C>T：p.S224L和6号外显子c.955G>A：p.E319k，2个变异位点均为错义变异，其中c.671C>T变异导致NR2E3蛋白第224位的丝氨酸改变为亮氨酸，c.955G>A变异导致第319位的谷氨酸改变为赖氨酸(图10)。c.671C>T变异在gnomAD数据库东亚人群中的频率为0，在ClinVar数据库中有意义未明的记录，未见文献报道。c.955G>A变异在gnomAD数据库东亚人群及ClinVar中均无收录，未见文献报道。SIFT、Polyphen2、MutationTaster预测2个变异产物均有害。ACMG遗传变异分类标准与指南显示2个变异均为临床意义未明变异。家系分析发现c.955G>A变异遗传自先证者父亲，由于其母亲去世，不能确定c.671C>T变异的来源。对人(Homosapiens)、牛(Bostaurus)、黑猩猩(Pantroglodytes)、小鼠(Musmusculus)、斑马鱼(Daniorerio)、鸡(Gallusgallus)的该变异位点对应的氨基酸序列进行比对，显示第224个和第319个位点在不同物种中均具有高度保守性(图11)，发生变异后致病可能性较高，结合临床表型，确诊为由NR2E3基因变异引起的ESCS。

图7 先证者双眼视野图像 可见双眼环形暗点和旁中心暗点 A：右眼灰度图 B：右眼模式偏差图 C：左眼灰度图 D：左眼模式偏差图Figure 7 Visual test results of the proband Ring scotomas and paracentral scotomas were seen in both eyes A:Gray map of right eye B:Pattern deviation map of right eye C:Gray map of left eye D:Pattern deviation map of left eye

图8 先证者双眼全视野ERG与正常人ERG对照表现 A1、B1：先证者右眼、左眼杆锥混合反应 暗适应0.01 ERG无波形，暗适应3.0 ERG a波振幅中-重度降低，b波振幅中度降低且潜伏期延长，暗适应10.0 ERG a、b波振幅中度降低且潜伏期延长 A2、B2：先证者右眼、左眼杆锥反应明适应3.0 ERG a、b波振幅轻度降低且潜伏期延长 A3、B3：先证者右眼、左眼30 Hz闪光刺激反应明适应3.0 ERG N1-P1波振幅中度降低 C1、C2、C3：正常对照杆锥混合反应、杆锥反应明适应3.0 ERG和闪光刺激反应明适应3.0 ERGFigure 8 Comparison of ERG between proband and normal control A1,B1:Mixed rod-cone response of right and left eye of proband It showed mixed rod-cone response without waveform in scotopic 0.01 ERG,moderate to severe reduction of a-wave,moderate decrease of b-wave and increased b-wave latency in scotopic 3.0 ERG,moderate reduction of a- and b-wave as well as increased a- and b-wave latency in scotopic 10.0 ERG A2,B2:Photopic 3.0 ERG of right (A2) and left eye (B2) of proband Mixed rod-cone response with mild reduction of a- and b-wave as well as increased a- and b-wave latency A3,B3:Moderately reduced N1-P1 amplitude in the right eye (A3) and left eye (B3) in photopic 3.0 flicker ERG (30 Hz) C1,C2,C3:Mixed rod-cone response,scotopic 3.0 ERG,and photopic 3.0 flicker ERG in normal control

图9 先证者双眼mfERG检查图 A1：右眼P1波3D显示中心注视 B1：左眼P1波3D显示旁中心注视，偏颞侧 A2、A3、A4、B2、B3、B4：可见1环N1和P1波振幅密度轻度下降、波形相对正常，而随离心度的增加，潜伏期延迟 A：右眼 B：左眼Figure 9 mfERG results of the proband A1:A 3D display of P1 wave showed central fixation in the right eye B1:A 3D display of P1 wave showed paracentral fixation with temporal deviation in the left eye A2,A3,A4,B2,B3,B4:In ring 1,amplitude density of N1 and P1 waves decreased with relatively normal waveform,and latency delayed as centrifugation increased A:right eye B:left eye

图10 该ESCS家系Sanger测序图 先证者NR2E3基因存在复合杂合变异，即c.671C>T/c.955G>AFigure 10 Sanger sequencing map of the ESCS family A compound heterozygous variation c.671C>T/c.955G>A was detected in NR2E3 gene in the proband

图11 NR2E3基因结构及变异位点保守性分析 NR2E3第224个和第319个氨基酸位点在人(Homo sapiens)、牛(Bos taurus)、黑猩猩(Pan troglodytes)、小鼠(mus musculus)、斑马鱼(Danio rerio)、鸡(Gallus gallus)的氨基酸序列中均高度保守Figure 11 NR2E3 structure and conservation analysis of variation Loci 224 and 319 of NR2E3 were highly conserved in amino acid sequences across Homo sapiens,Bos taurus,Pan troglodytes,mus musculus,Danio rerio and Gallus gallus

3 讨论

本研究先证者2岁发现夜盲，诊断为夜盲症。入院后经ERG及OCT检查显示患者视杆、视锥细胞功能受损，黄斑区视网膜层间多个小劈裂腔，双眼为调节性内斜视，暗适应功能障碍，临床表型与ESCS症状相符。基因测序发现，先证者NR2E3基因存在2个未报道的c.671C>T:p.S224L、c.955G>A:p.E319K变异位点，该复合杂合变异导致了患者ESCS的发生。

PubMed数据库中共检索到78篇与ESCS相关的文献。既往报道的NR2E3基因变异导致的ESCS文献中有84个突变位点，包括58个错义突变、15个剪切突变、6个移码突变、4个缺失突变、1个无义突变，其中3个位于N端的A/B结构域，24个位于DNA结合域，5个位于铰链区，37个位于配体结合域，c.119-2A>C和c.932G>A(p.R311Q)是其中常见的2个突变位点[3-29]。

ESCS是一种由染色体15q23核受体基因NR2E3变异导致的常染色体隐性遗传视网膜营养不良，患者在儿童时期眼底正常或在视网膜色素上皮有少量白点，视网膜团块状色素沉着多发生于9～11岁，黄斑囊样改变不伴有FFA荧光素渗漏或劈裂[30-31]。人类视网膜有短波敏感型(S，蓝)、中波敏感型(M，绿)和长波敏感型(L，红)视锥光感受器。大多数遗传性视网膜营养不良视杆细胞和视锥细胞呈进展性退行性改变。然而，ESCS呈现短波视锥细胞功能增强，中波及长波视锥细胞功能受损、视杆细胞功能记录不到。因此该患者暗适应下低强度光(0.01)刺激ERG各波记录不到，高强度光(3.0)刺激记录到大而慢的反应波，随背景光强度增加(明适应)该波形无变化。人NR2E3基因变异导致常染色体显性和常染色体隐性视网膜色素变性、Goldmann-Favre综合征、色素集群视网膜变性以及ESCS等多种视网膜疾病[16,32-37]。ESCS与Goldmann-Favre综合征临床表型有相似之处，后者被认为是前者的严重类型[37]。NR2E3基因编码1条包含410个氨基酸、相对分子质量为45 000的多肽。NR2E3蛋白包含氨基端的A/B结构域、DNA结合结构域、铰链区以及羧基端的配体结合结构域，其中DNA结合结构域负责结合靶基因的启动子，配体结合结构域负责与配体结合，但NR2E3的配体还未明确；铰链区为NR2E3的核定位信号[8,38-39]。NR2E3缺失的rd7小鼠视杆细胞能够正常发育、分化和成熟[1，40-43]，NR2E3基因在人和斑马鱼中是保守的，NR2E3基因变异的斑马鱼视杆前体细胞不能分化为成熟的视杆细胞，ESCS患者视杆细胞功能在早期即严重损伤[44]，出现夜盲症状。

ESCS、先天性静止性夜盲、无色素性视网膜色素变性早期均表现为夜视力差，轻中度视力下降，视野正常，仅依靠主诉和眼底表型难以鉴别，但各自具有不同的ERG特征，当不能明确鉴别时应行ERG检查，同时结合基因检测进一步明确诊断。ESCS表型有很高的异质性，许多视网膜细胞退化和NR2E3基因变异的因果关系尚不清楚，不同物种中NR2E3基因变异后表型也有一定差异，导致NR2E3的功能研究具有一定困难。本家系先证者21岁，眼底病情发展变化有赖于长期的随访观察和更深入的遗传学研究。

本研究发现了NR2E3基因中2个未报道的突变位点c.671C>T:p.S224L和c.955G>A:p.E319K，丰富了常染色体隐性遗传ESCS的基因变异谱，为研究其致病机制提供了有用信息，同时可以为临床开展遗传咨询和生育指导提供参考依据。

利益冲突所有作者均声明不存在任何利益冲突

作者贡献声明蒋永强：直接参与选题、设计试验、实施研究、采集数据、起草文章；郭浩轶：酝酿和设计试验，对文章知识性内容进行审阅和修改；李杰、陈慷：分析/解释数据