非衍生化/液相色谱-串联质谱法测定果蔬中氨基酸类有机磷除草剂残留

林丽敏，张建莹*，肖 锋，黄 科，叶 刚，洪小柳，吕 飞

（1．深圳海关食品检验检疫技术中心，广东 深圳 518045；2．惠州海关技术中心，广东 惠州 516006）

除草剂广泛应用于农业种植中。随着农业科技日益更新和抗除草剂转基因作物的崛起，氨基酸类有机磷除草剂的市场占有率飞速增长，成为23类除草剂之首［1］。氨基酸类有机磷除草剂是指带有氨基和膦酸基团的氨基酸类除草剂，主要包括草甘膦、草铵膦、双丙氨膦。该类除草剂对于人体伤害的报道越来越多。研究发现，草铵膦介导抑制谷氨酰胺生成影响中枢系统兴奋性，可能引起患者意识障碍、呼吸衰竭［2］。欧洲化学品管理局研究报告显示，草甘膦可能会伤害人类眼睛和水生生物［3］。欧盟食品安全局将153种农产品的限量从0．1~50 mg/kg降至0．05 mg/kg［4］。GB 2763-2021规定谷物、蔬菜、水果等日常食品中草甘膦和草铵膦的最大残留限量分别为0．1~5 mg/kg和0．1~0．9 mg/kg［5］。

目前，针对草甘膦、氨甲基膦酸、草铵膦的研究较多，双丙氨膦的研究报道较少。蔬菜、水果中草甘膦、氨甲基膦酸、草铵膦的检测主要采用衍生/液相色谱-串联质谱法［6］。免疫法、毛细管电泳法和离子色谱法的灵敏度低，不能满足法律规定的限量要求［7-9］。由于氨基酸类有机磷除草剂具有极性高、不易挥发、不溶于大部分有机溶剂等特点，需将目标物衍生化后进行检测。常用的氯甲酸-9-芴基甲酯（FMOC）、三氟乙酸酐和七氟丁酰咪唑等衍生试剂［10］具有刺激性气味，易挥发，吸入后会灼伤人体黏膜，且需使用阳离子交换柱，成本较高，净化操作繁琐，检测效率低。张云峰等［11］建立了一种非衍生化高效液相色谱-串联质谱快速检测生物体液中草甘膦、草铵膦及其代谢物等8种极性农药的方法；Jake等［12］建立了一种非衍生化高效液相色谱-串联质谱快速测定水中草甘膦及其代谢物氨甲基磷酸的方法；非衍生化高效液相色谱-串联质谱法测定土壤［13］、茶叶［14］、面粉及燕麦［15］和植物油［16］中草甘膦、草铵膦及其代谢物的研究亦有报道。但非衍生化液相色谱-串联质谱法用于果蔬中氨基酸有机磷类残留的检测尚未见报道。

本文以蔬菜、水果为研究对象，以常见的草甘膦、氨甲基膦酸、草铵膦、双丙氨膦为检测目标物，采用非衍生化方法，建立了蔬菜、水果中4种氨基酸类有机磷除草剂的液相色谱-串联质谱检测方法。该方法具有快速简便、灵敏度高、成本低、稳定性好等特点，有助于在监管范围、检测技术和时效性等方面提升果蔬食品中氨基酸类有机磷除草剂的监测能力。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

岛津8050液相色谱-串联质谱仪（日本岛津公司）；Talboys多管式涡旋振荡仪（美国Troemner公司）；3K18高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；Milli-Q Integral 10+高纯水发生器（美国Millipore公司）；Vac Elut固相萃取装置（美国Agilent公司）；0．22 μm有机滤膜（上海安谱实验科技股份公司）。

甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯，上海安谱实验科技股份公司）；乙酸铵（色谱纯，德国Sigma公司）；二氯甲烷（分析纯，中国Ghtech公司）；实验用水为Milli-Q超纯水；N-丙基乙二胺吸附剂（GCB，美国Supelco公司）；Oasis HLB柱（6 mL/200 mg，美国Waters公司）。标准物质：草甘膦（CAS号：1071-83-6，纯度99．0%）；氨甲基膦酸（AMPA，CAS号：1066-51-9，纯度99．0%）；草铵膦（CAS号：51276-47-2，纯度99．0%）；草甘膦同位素内标（IS，CAS号：1185107-63-4，纯度97．3%）；双丙氨膦钠盐（CAS号：71048-99-2，纯度72．4%）。

1.2 样品处理

1.2.1 提取称取5．00 g试样（精确至0．01 g）于50 mL具塞离心管中，加入50 μL 10．0 mg/L草甘膦同位素内标、25 mL水和10 mL二氯甲烷，涡旋振荡提取20 min，9 500 r/min离心5 min，上清液待净化。对于柑橘类等酸度较大的水果，取5 mL上清液，加入20 μL氨水调至pH 9，涡旋振荡均匀，待净化。

1.2.2 净化HLB固相萃取柱用5 mL甲醇和5 mL水预淋洗，弃去淋洗液；吸取提取上清液5 mL通过HLB固相萃取柱，收集滤液，涡旋，取1 mL滤液过0．22 μm滤膜，待测定。

1.3 色谱条件

色谱柱：Thermo Scientific Hypercarb（100 mm×2．1 mm i．d．，3 μm，美国Thermo公司）。流动相：A为0．2%甲酸水，B为乙腈。等度洗脱程序：0~10．0 min，5% B。进样量：5 μL；流速：0．25 mL/min；柱温：40℃。

1.4 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI），离子源温度：300℃；雾化气流速：3 L/min；加热气流速：10 L/min；驱动气流速：10 L/min；负离子模式；质谱扫描方式：多反应监测（MRM）；DL温度：250℃；加热块温度：400℃；驻留时间：100 ms。其他质谱参数见表1。

表1 5种化合物的质谱参数Table 1 Mass spectrum parameters for the detection of 5 compounds

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

比较了Poroshell 120 EC-C18（100 mm×2．1 mm i．d．，2．7 μm）、ACQUITY UPLC BEH HILIC（150 mm×3．0 mm i．d．，1．7 μm）以及Thermo Scientific Hypercarb（100 mm×2．1 mm i．d．，3 μm）3种色谱柱对4种氨基酸类有机磷及内标物的色谱保留情况。结果显示，5种物质在Poroshell 120 EC-C18和Thermo Scientific Hypercarb柱上有保留，在ACQUITY UPLC BEH HILIC柱上无保留。各化合物在Thermo Scientific Hypercarb柱上的分离效果和质谱响应较好，最终选择该柱作为分析柱。

2.2 流动相的选择

对比了5种流动相：A（乙腈-0．005 mol/L乙酸铵）、B（甲醇-0．005 mol/L乙酸铵）、C（甲醇-0．2%甲酸水）、D（乙腈-0．1%甲酸水）、E（乙腈-0．2%甲酸水）对分离效果的影响。结果显示，在流动相中加入0．005 mol/L乙酸铵时，草甘膦及内标的响应较低，双丙氨膦不出峰；用甲酸水作为水相，草甘膦、草甘膦内标、双丙氨膦均出峰，但响应不高。随着水相中甲酸含量的提高，草甘膦和草甘膦内标的峰形变好，双丙氨膦的响应提高（见图1）。因乙腈的洗脱能力较甲醇强，待测物的峰形较甲醇流动相更好。最终确定以乙腈-0．2%甲酸水作为流动相。

图1 不同流动相对5种化合物质谱响应的影响Fig．1 Effect of different mobile phases on mass spectrum response of 5 compounds

2.3 提取溶剂的选择

氨基酸类有机磷除草剂非衍生法的常用提取溶剂有氢氧化钠［13］、水［14-15］、水与乙腈混合溶液［16］等。本文考察了水、水-二氯甲烷（5∶2，体积比）混合溶液对5种化合物的提取效果。结果表明，对于脂溶性杂质较少的水果样品，采用上述2种提取溶剂，5种化合物的提取率在80%以上；但对于榴莲等脂溶性杂质较多的水果样品，采用水-二氯甲烷（5∶2）混合溶液作为提取溶剂可以破乳破酯，提高提取效率，比单纯使用水作为提取溶剂效果更佳。综合考虑，采用水-二氯甲烷（5∶2）作为提取溶剂。

2.4 净化条件的选择

植物源性食品中含有大量色素及水溶性和脂溶性杂质，其中水果样品含有高糖等有机物，需净化去除提取液中的水溶性糖分、水溶性色素等干扰物质。二氯甲烷微溶于水，可溶解多种有机化合物杂质。石墨化炭黑（GCB）对果蔬中的色素（如叶绿素和类胡萝卜素）及固醇类等系列化合物具有很强的吸附能力。HLB固相萃取柱具有亲水-亲脂平衡化学结构，是疏水性强且具有良好水浸润性的聚合物吸附剂，可吸附部分脂肪、脂溶性杂质，除色素效果较好。LC-18固相萃取柱能较好去除脂肪和脂溶性杂质。本文分别比较了二氯甲烷液液萃取净化、GCB分散固相萃取净化、Oasis HLB（6 mL/200 mg）、Supelclean LC-18（6 mL/500 mg）固相萃取柱的净化效果以及二氯甲烷液液萃取法结合Oasis HLB（6 mL/200 mg）固相萃取柱净化的效果。结果显示，单独采用二氯甲烷液液萃取、GCB分散固相萃取净化时，净化液的干扰峰多，目标物响应较差；提取液经Oasis HLB萃取柱净化后，干扰峰少，但草甘膦的峰形较差；经LC-18固相萃取柱净化后，AMPA的峰形差，且目标物的响应低；采用二氯甲烷和Oasis HLB萃取柱两者结合的净化模式净化，则净化液的检测峰少，目标物的响应较高。这可能是由于在水基质提取液中，二氯甲烷在净化去除部分水溶性糖分、可溶解有机化合物等杂质后，Oasis HLB萃取柱可进一步去除色素、亲水性干扰物，两者起到互补作用，净化更好。

综上所述，本方法选取二氯甲烷液液萃取法结合Oasis HLB（6 mL/200 mg）固相萃取柱对提取液进行净化。

2.5 方法学验证

2.5.1 线性方程、检出限与定量下限用水稀释混合标准溶液，配成质量浓度为0．010、0．020、0．050、0．100、0．200 mg/L的混合标准工作溶液（同位素内标物的质量浓度均为50 μg/L），以峰面积对标准溶液中各被测组分的质量浓度绘制工作曲线。结果表明，4种目标化合物在0．010~0．200 mg/L范围内线性关系良好，相关系数（r）均大于0．996。分别以3倍信噪比和10倍信噪比确定方法检出限和定量下限，4种目标化合物的检出限均为0．01 mg/kg，定量下限均为0．05 mg/kg。4种氨基酸类有机磷除草剂及内标的MRM谱图见图2。

图2 4种氨基酸类有机磷除草剂及内标的MRM谱图Fig．2 MRM chromatograms of 4 phosphorus-containing amino acid herbicides and the internal

2.5.2 准确度与精密度采用空白的柑橘、葡萄、麦菜作为验证基质进行加标实验，加标水平为0．050、0．100、0．200 mg/kg，每个水平做6个平行。按照本方法进行前处理和检测，采用内标法定量。由表2可知，3个加标水平下4种化合物的平均回收率为72．2%~109%，相对标准偏差（RSD，n=6）为2．2%~11%，方法的准确度和精密度较好。

表2 4种氨基酸类有机磷除草剂的相关系数（r）、回收率及相对标准偏差Table 2 Correlation coefficients（r），recoveries and relative standard deviations of four amino acid organophosphorus herbicides

（续表2）

2.5.3 方法的实际应用采用该方法检测10批次鲜柑橘、10批次鲜葡萄和10批次麦菜，结果发现2批次鲜柑橘样品中检出草甘膦，检出量均小于定量下限。

3 结论

本文采用水-二氯甲烷（5∶2）混合溶剂提取目标物，提取液经二氯甲烷液液萃取、HLB固相萃取柱净化，建立了果蔬中4种氨基酸类有机磷除草剂的非衍生化/液相色谱-串联质谱测定方法。该法操作简便，试剂用量少，灵敏度高，稳定性好，且具有较高的回收率、良好的精密度，可满足果蔬中氨基酸类有机磷除草剂的检测要求。