固相萃取/超高效液相色谱-串联质谱法测定稻渔水体中氟虫腈及其代谢物

马丽莎，郑光明，尹 怡，谢文平，单 奇，林嘉薇，李丽春，刘书贵，赵 城，戴晓欣，魏琳婷

（中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业农村部外来入侵水生生物防控重点实验室，广东省水产动物免疫与绿色养殖重点实验室，广东 广州 510380）

稻渔综合种养模式是我国主推的水产养殖绿色生产技术，然而农药污染却对其混养水产品的质量安全造成潜在威胁。氟虫腈是一种昆虫γ-氨基丁酸受体阻滞剂［1］，因具有广谱、高效的杀虫活性而在世界范围内得到广泛使用。但氟虫腈具有环境持久性、生物蓄积性、高毒性等均危害［2-3］，且在环境中可代谢成强于自身毒性的氟甲腈、氟虫腈砜等代谢物［4］。因此，欧盟、美国及我国等均制定了食品中氟虫腈的最大残留限量［5-6］，同时欧盟及我国严禁在水稻等农作物病虫害防治上使用氟虫腈［7-8］。但目前我国农产品中仍有检出氟虫腈及其代谢物的报道［9］，表明我国农业生产活动中存在氟虫腈超剂量、超范围使用的问题。喷洒于农作物的氟虫腈有60%~98%滞留于土壤或空气粉尘中［10］，可通过降水、灌溉、浸出等形式迁移至水环境中［11］，在稻渔水产品中形成富集，从而引发稻渔水产品质量安全问题，再经食物链进入人体，危害人体健康。

目前国内外水体中氟虫腈及其代谢物的测定多集中于江河、城市污水及养殖水体等［12-15］，尚无稻渔水体的研究报道。稻渔水体受农业及渔业活动的双重影响，富含土壤微粒、藻类、脂类、色素及腐殖酸等干扰物，其基质成分与上述水体差异较大，故文献方法不一定适用于稻渔水体。鉴于氟虫腈已受到全球监管系统的高度关注［16］，欧盟“毒鸡蛋事件”更将其推上风口浪尖，而我国稻渔水体可能已受到氟虫腈污染，且农药污染主要通过养殖水体迁移至水产品中，因此为保障我国稻田渔业的绿色发展，建立稻渔水体中氟虫腈及其代谢物残留的检测方法至关重要。

水样中农药残留分析的前处理方法有液液萃取法、吹扫捕集法、固相萃取法（SPE）及固相萃取膜片法等，但液液萃取法存在有机溶剂用量大、操作复杂、易乳化等缺点，吹扫捕集法及固相萃取膜片法的价格较昂贵，而固相萃取法集富集与净化为一体，具有溶剂用量少、价格低、操作方便等优点，广泛用于水样前处理。本研究采用SPE/超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）分析稻渔水体中的氟虫腈及其代谢物，方法操作简便、灵敏、高效，方法检出限为0．5 ng/L，低于环境水体中氟虫腈及其代谢物的常见浓度（1．5~200 μg/L）［13］。方法的建立可为稻渔水体中氟虫腈及其代谢物的风险监测与评估提供技术支撑，对控制和监管稻渔水体中氟虫腈及其代谢物残留，确定其对稻渔水产品的安全隐患具有重要的现实意义。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

安捷伦6470三重四极杆液相色谱-质谱联用仪（美国安捷伦公司）；12通道半自动固相萃取装置（美国嘉仕达公司）；Supelco ENVI-18 SPE柱（500 mg/3 mL，美国Supelco公司）；Oasis HLB SPE柱（500 mg/6 mL，美国沃特世公司）；Bond Elut SAX SPE柱（500 mg/6 mL，美国安捷伦公司）；Whatman玻璃纤维滤纸（1．6、0．7 μm，英国沃特曼公司）；混合纤维素酯微孔滤膜（0．8 μm，上海兴亚净化材料厂）；C18固相萃取膜片（47 mm，德国Sigma-Aldrich公司）。

氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜和氟虫腈亚砜标准品（纯度均＞99%，德国Dr．Ehrenstorfor公司）；乙腈、二氯甲烷（色谱纯，美国Honeywell公司）。

1.2 实验条件

1.2.1 标准储备液的配制分别称取氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜及氟虫腈亚砜标准品各10 mg（精确至0．01 mg），用乙腈定容至10 mL，配制成1．0 mg/mL的标准储备液。

空白基质提取液：阴性样品按照“1．2．2”和“1．2．3”条件进行前处理，获得空白基质提取液。

混合标准溶液：分别取上述标准储备溶液，用乙腈定容为1 000 ng/mL的混合标准溶液，临用前以空白基质提取液配制成0．5~100 ng/mL的工作曲线溶液。

1.2.2 水样的采集与过滤采集表层（0~0．5 m）水样，经1．6 μm玻璃纤维滤纸过滤去除较大杂质，再经0．7 μm玻璃纤维滤纸过滤后，备用。

1.2.3 样品的浓缩依次用6 mL乙腈和6 mL去离子水活化Supelco ENVI-18 SPE柱，量取500 mL水样以约3 mL/min过柱，再用6 mL去离子水淋洗SPE柱，弃去流出液后抽干，最后用9 mL乙腈洗脱。洗脱液置于50℃氮吹仪吹干，用乙腈定容至0．5 mL，过有机膜，待测。

1.2.4 UPLC-MS/MS条件色谱柱：安捷伦SB-C18柱（2．1 mm×100 mm，1．8 μm）；柱温：35℃；流动相：A为0．1%甲酸水（含5 mmol/L乙酸铵），B为乙腈；梯度洗脱条件：0~1 min，40% B；1~4 min，40%~80% B；4~6 min，80% B；6~6．1 min，80%~40% B；6．1~8 min，40% B；进样量：5 μL；流速：0．4 mL/min。

离子源：电喷雾电离源，负离子模式；扫描方式：多反应监测（MRM）模式；鞘气温度：350℃，喷雾电压：3 500 V，鞘气流速：12 L/min，干燥气流速：10 L/min，雾化气压力：3．10×105Pa，离子源温度：325℃。目标化合物的其他质谱参数见表1。

表1 氟虫腈及其代谢物的质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters for fipronil and its metabolites

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 滤膜的选择玻璃纤维滤纸及混合纤维素酯滤膜均可用于水样预处理。实验发现，稻渔水样较混浊，含大量土壤微粒、藻类等杂质，采用混合纤维素酯滤膜过滤水样时杂质会堵塞滤膜导致流速较慢，而玻璃纤维滤纸过滤水样时无堵塞且流速较快。这可能与玻璃纤维滤纸具有毛细纤维结构有关，与同等纤维素滤纸相比，玻璃纤维滤纸可吸附更多水分，且其聚酯分隔层使其具有较强通透性利于液体滤过。故实验选用玻璃纤维滤纸。

2.1.2 萃取方式的选择固相萃取法具有溶剂用量少、操作方便、价格低廉等优点，是环境水样常用的前处理方法。固相萃取膜片（SPE disk）是近年环境监测领域备受关注的固相萃取技术，其流速可达10~100 mL/min，尤其适用于大体积水样中残留物的萃取。实验分别于500 mL阴性稻渔水样中添加5 ng氟虫腈及其代谢物，分别采用上述两种方法萃取水样中的目标物，并比较两者的回收率、实验效率及性价比。结果表明：SPE及SPE disk法［13］的回收率均在70%~120%之间，SPE disk法的实验效率为SPE法的4倍，但其膜片的价格为SPE柱的10倍，且SPE disk法一次仅能处理1个水样，SPE法一次可同时处理24个水样。可见当取样量较少时，SPE disk法的优势并不明显，SPE法的性价比相对较高，故实验选择SPE法。

2.1.3 固相萃取柱的选择氟虫腈及其代谢物为亲脂性化合物［15］，Oasis HLB小柱可保留亲水和亲脂的化合物，被用于江河、养殖水体等环境水体中氟虫腈及其代谢物的测定［12，14］。但实验表明：Oasis HLB小柱对稻渔水样的净化效果差，定容液浑浊呈黄色，总离子流图（TIC）基线噪音大，基质效应大于50%。这可能与稻渔水样富含亲水、亲脂性的脂类、色素、腐殖酸等干扰物有关。稻渔水样受农业活动的影响，含有的色素、腐殖酸等杂质多于江河、养殖水体等，而芳香结构的腐殖酸极性强，聚脂肪结构的腐殖酸极性较低［17］，Oasis HLB小柱在富集目标化合物的同时也吸附了脂类、色素、腐殖酸等干扰物，强极性的乙腈可洗脱极性较大的色素及腐殖酸，因此Oasis HLB小柱的洗脱液呈黄色，其不适用于稻渔水体中氟虫腈及其代谢物的分析。

鉴于氟虫腈及其代谢物呈弱酸性，在碱性环境下易解离、极性偏弱［18-19］，实验分别选用对弱极性化合物有强保留作用的Supelco ENVI-18 SPE柱及可萃取水样中弱酸性化合物的Bond Elut SAX强阴离子交换SPE柱净化稻渔水样并富集目标物。结果显示：两柱对稻渔水样的净化效果均较好，定容液清澈透明，TIC图基线噪音较小。但Bond Elut SAX柱对目标物的回收率偏低，为27．5%~87．3%，而Supelco ENVI-18 SPE柱的回收率为92．4%~101%，基质效应的绝对值为0．30%~38%，符合农药残留分析要求。可见，Supelco ENVI-18 SPE柱更适用于稻渔水样中氟虫腈及其代谢物的测定，其在富集目标物的同时虽也吸附了稻渔水样中脂类、腐殖酸等弱极性干扰物，但乙腈对这些弱极性干扰物的洗脱能力较小，因此乙腈洗脱溶液清澈透明，质谱图基线噪音较小。故实验选用Supelco ENVI-18柱。

2.1.4 固相萃取柱洗脱条件的优化洗脱剂是决定回收率的关键因素。氟虫腈及其代谢物与乙腈均含有—CN基团，易被乙腈萃取出来［20］。但氟虫腈及其代谢物的极性偏低，考虑到极性较大的乙腈对其溶解度可能较差，洗脱难度较大。故实验比较了乙腈、乙腈-二氯甲烷（8∶2，体积比，下同）、乙腈-二氯甲烷（6∶4）3种不同极性溶剂的洗脱效果（见图1）。结果显示，乙腈洗脱的回收率优于其余两种洗脱溶剂，这可能与乙腈和目标物含相同的化学结构有关。有机溶剂的极性及化学结构均能影响其对目标物的洗脱效率，3种洗脱溶剂中乙腈-二氯甲烷（6∶4）的乙腈含量最低，因此其对目标物的洗脱效果最差。故实验选择乙腈作为洗脱溶剂，并在洗脱前用6 mL去离子水淋洗SPE柱，以除去富集在小柱上的水溶性杂质。

图1 3种洗脱溶剂对氟虫腈及其代谢物的回收率比较Fig．1 Comparison of the three elution solvents on recoveries of fipronil and its metabolites

2.1.5 氮吹温度的选择氮吹温度过高会导致目标物降解，影响回收率，过低则会导致浓缩时间过长，降低实验效率，故选择合适的氮吹温度十分重要。考察了不同氮吹温度（30、40、50、60℃）对氟虫腈及其代谢物回收率的影响（图2），发现当氮吹温度为60℃时，目标物的回收率下降明显；氮吹温度为50℃时，不仅可获得良好的回收率（91．8%~106%），还可缩短氮吹时间，故选择氮吹温度为50℃。

图2 氮吹温度对稻渔水体中氟虫腈及其代谢物回收率的影响Fig．2 Effects of nitrogen blowing temperatures on recoveries of fipronil and its metabolites in rice fishing water

2.2 基质效应

采用ME=（基质匹配标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率-1）×100%的计算方法［21］考察基质效应（ME）。若|ME|＜20%，表明存在较弱的基质效应；若20%＜|ME|＜50%，表明存在中等的基质效应；若|ME|＞50%，表明存在较强的基质效应。结果显示：氟虫腈及其代谢物在稻渔水样的|ME|为0．30%~38%（见表2），表明稻渔水样对目标物存在基质影响，因此实验采用基质标准曲线法进行定量。

2.3 方法评价

2.3.1 线性范围、检出限及定量下限用空白样品的提取溶液分别配制氟虫腈及其代谢物的系列基质标准工作液，质量浓度为0．5、1、2、5、20、100 ng/mL，按“1．2．4”条件进行分析，外标法定量。以目标物的质量浓度（x，ng/mL）为横坐标，对应的定量离子峰面积（y）为纵坐标进行线性回归分析，并分别以信噪比S/N≥3和S/N≥10确定检出限（LOD）和定量下限（LOQ）。结果显示，氟虫腈及其代谢物在0．5~100 ng/mL范围内具有良好的线性关系，相关系数（r2）均大于0．998，检出限均为0．5 ng/L，定量下限均为1．5 ng/L（见表2）。

表2 氟虫腈及其代谢物的线性关系、基质效应、检出限、定量下限、加标回收率及相对标准偏差Table 2 Linear relations，matrix effects，LODs，LOQs，recoveries and relative standard deviations of fipronil and its metabolites

2.3.2 回收率与相对标准偏差在空白稻渔水样中分别添加3个不同浓度水平的氟虫腈及其代谢物混合标准溶液，每个水平做6个平行样，进行加标回收实验（见表2）。结果表明，氟虫腈及其代谢物的平均回收率为81．6%~105%，相对标准偏差（RSD）为3．5%~7．0%，方法准确度和精密度均满足分析要求。加标稻渔水样的提取离子色谱图见图3。

图3 稻渔水样（加标量为50 ng/L）的提取离子色谱图Fig．3 Extracted ion chromatograms of fipronil and its metabolites of rice fishing water samples（spiked 50 ng/L）

2.4 实际样品检测

为验证方法的可靠性和实用性，采用本方法对采集于广东省稻渔综合种养池塘的13份稻渔水样进行分析。结果显示有1份水样检出氟虫腈及氟虫腈砜，质量浓度分别为1．03、1．71 ng/L，而作者在稻渔水产品［22］及稻渔土壤［23］中也检出氟虫腈及其代谢物，表明我国部分稻渔水产品可能已受到氟虫腈及其代谢物的影响，建议进一步加强其在稻渔水产品及稻渔养殖环境中残留量的监控。

3 结论

本文建立了检测稻渔水体中氟虫腈及其代谢物的SPE/UPLC-MS/MS法。方法具有灵敏度高、准确性好、价格低廉、实用性强等优点，具有在基层检测机构普及推广的潜力，可满足稻渔水体中氟虫腈及其代谢物残留的监测需要，适用于稻渔水体中氟虫腈及其代谢物残留的批量分析。