DMBA衍生/超高效液相色谱法测定鱼肉中唾液酸含量

李佩佩，严忠雍，陈 荫，何鹏飞，黄丽英，方 益

（1．浙江省海洋水产研究所，浙江 舟山 316021；2．浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室，浙江 舟山 316021；3．浙江省海洋生物医用制品工程技术研究中心，浙江 舟山 316021）

唾液酸（SAs）是一类酸性氨基糖，为神经氨酸的N-或O-取代衍生物。其主体结构是由9个碳原子和氧原子构成的带1个环外侧链的六元环，在C1处有1个羧基，C4、C7、C8、C9处各有1个羟基［1］。唾液酸种类多样，自然界中已发现80余种［2］，一般根据C5取代基团的不同（N-乙酰基、N-羟乙酰基和羟基）将唾液酸分成3种核心结构：N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）、N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）和酮基-脱氧壬酮糖酸（KDN）。其他唾液酸均为上述3种结构的乙酰化、甲基化、巯基化或酯化等的衍生物［3-4］。3种核心结构的唾液酸如图1所示。

图1 唾液酸的3种基本结构形式Fig．1 Structures of the three basic forms of sialic acid

作为生物糖家族中的一大类，唾液酸主要以结合态广泛存在于各类生物组织及少量微生物中，是糖蛋白、低聚糖和糖脂的重要成分［5-6］。发生在C4、C7、C8、C9位点上乙酰基、磺酸基、乳酰基、磷酸基等活性基团的取代使得唾液酸具有丰富多样的结构和复杂重要的生理功能：参与细胞间相互作用、细胞粘附与分化、细胞间的信息传导以及免疫应答等过程［7-8］；作为一种天然的大脑营养素，促进人体神经系统成长发育，促进婴幼儿大脑发育和提高记忆力［9］；调节大量生理病理过程，在抗炎、抗病毒、抗肿瘤等方面发挥重要作用［10-13］。由于唾液酸多糖本身结构复杂且性质不稳定，通常样本量很小，因此对分析方法的要求很高，研究唾液酸和唾液酸多糖时，需要建立高效适用的检测方法。目前应用最广泛的检测方法为色谱法［14-15］。唾液酸主要以结合态形式存在，一般需先通过水解将其从糖链的末端释放出来，再采用化学衍生手段获得稳定的结构。

目前唾液酸的检测对象涉及燕窝［16-17］、乳及乳制品［18-19］、牛奶［20］、血浆［21-22］、畜禽动物组织［23-24］等，对鱼肉基质研究较少。研究表明猪、牛、羊肉等红肉中含有Neu5Ac和Neu5Gc，而鱼肉、鸡肉等白肉中仅含有Neu5Ac［25］。Neu5Gc属于外源性唾液酸，进入人体后会刺激炎症的发生，增大患癌风险［26］。因此，目前很多研究更重视红肉中Neu5Gc的解离，对居民日常消费量同样很高的鱼肉研究相对较少；在含量测定方面多集中于对Neu5Ac和Neu5Gc的测定，缺乏对KDN的测定；检测一般采用普通的高效液相色谱仪，出峰时间长。为了解不同品种鱼肉中的唾液酸含量，本文采用超高效液相色谱建立了水产品中常见唾液酸Neu5Ac和Neu5Gc以及含量较低的KDN的检测方法，前处理中采用4，5-二甲基-1，2-苯二胺（DMBA）衍生法代替4，5-亚甲二氧基-1，2-邻苯二胺盐（DMB）衍生反应，并应用建立的方法测定了不同品种鱼肉中的唾液酸含量，有助于了解膳食中唾液酸的摄入比例以及对人体健康的影响。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

AcquityTMUltra Performance超高效液相色谱仪（配备荧光检测器，美国Waters公司）；MS2漩涡混合器（德国IK公司）；Avanti JXN-30智能型低温超高速离心机（美国Beckman Coulter公司）；Centrivap®真空冷冻干燥机（美国Labconco公司）；ZD-85A气浴恒温振荡器（常州市国旺仪器制造有限公司）；Milli-Q Gradient超纯水净化器（美国Millipore公司）；N-EVAP112氮吹仪（美国Organomation公司）。

N-乙酰神经氨酸（CAS号：131-48-6，纯度大于95%），N-羟乙酰神经氨酸（CAS号：1113-83-3，纯度大于95%），酮基-脱氧壬酮糖酸（CAS号：153666-19-4，纯度大于98%）均购自Sigma公司。

4，5-亚甲二氧基-1，2-邻苯二胺盐、4，5-二甲基-1，2-苯二胺，购自阿拉丁试剂（上海）有限公司；盐酸、乙酸、氢氧化钠、连二亚硫酸钠均为分析纯，β-巯基乙醇为生化试剂，均购自上海国药集团化学试剂有限公司；乙腈（色谱纯）购自德国Merck公司；实验用水为Milli-Q制备超纯水（电阻率≥18．2 MΩ·cm）。

Neu5Ac、Neu5Gc和KDN标准溶液的配制：准确称取3种标准品各10．00 mg，分别用水溶解并定容至10 mL，得到质量浓度均为1．00 mg/mL的单一标准储备液。实验中根据需要用水稀释成不同质量浓度的混合标准工作溶液。

DMB衍生溶液的配制：准确称取29．3 mg DMB、24．4 mg连二亚硫酸钠，加入528 μLβ-巯基乙醇、859 μL乙酸，用水溶解并稀释定容至10 mL。所得衍生溶液中各组分浓度为：13 mmol/L DMB、1．5 mol/L乙酸、14 mmol/L连二亚硫酸钠、0．75 mol/Lβ-巯基乙醇。

DMBA衍生溶液的配制：准确称取67．6 mg DMBA，加入2．29 mL乙酸，用水溶解并稀释定容至10 mL。所得衍生溶液中各组分浓度为：49 mmol/L DMBA、4．0 mol/L乙酸。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理将鱼去鳞、去皮，沿脊背取肌肉切成不大于0．5 cm×0．5 cm×0．5 cm的小块后混匀，充分匀浆，-18℃以下冷冻保存备用。

称取5．0~10 g匀质样品置于真空冷冻干燥机中冻干，研磨成粉末。称取1．0 g粉末于15 mL离心管中，加入2 mL 0．1 mol/L氢氧化钠溶液，37℃水浴30 min，加入8 mL 0．6 mol/L盐酸溶液，80℃酸解20 min，冰水浴冷却至室温。停止反应后以13 000 r/min离心10 min，收集上清液进行衍生反应。

1.2.2 衍生反应DMB衍生反应：取酸解后的样品上清液或某一浓度的标准溶液100 μL，与100 μL衍生化试剂溶液混匀，50℃振荡避光衍生90 min，冷却至室温，经0．22 μm滤膜过滤后待测。

DMBA衍生反应：取酸解后的样品上清液或某一浓度的标准溶液100 μL，与100 μL衍生化试剂溶液混匀，60℃振荡避光衍生60 min，冷却至室温，经0．22 μm滤膜过滤后待测。

1.2.3 色谱条件Waters Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2．1 mm，1．7 μm）；进样量为10 μL；样品室温度为10℃，柱温为40℃。荧光检测器，DMB衍生物：激发波长为373 nm，发射波长为448 nm；DMBA衍生物：激发波长为379 nm，发射波长为432 nm。流动相：A为纯水，B为乙腈，梯度洗脱条件为：0~1．5 min，92%A；1．5~2．5 min，92%~91%A；2．5~4．0 min，91%A；4．0~4．1 min，91%~85%A；4．1~8．0 min，85%A；8．0~8．3 min，85%~92%A；8．3~11．0 min，92%A。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

唾液酸具有较强的极性且不稳定，因此需通过衍生以稳定其结构，加强其在C18色谱柱上的保留，同时提高检测灵敏度和改善色谱分离度。Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2．1 mm，1．7 μm）具有柱效高和分离时间短的特点，实验选择纯水和乙腈作为流动相，通过改进梯度洗脱条件以获得尖锐对称的色谱峰形和最佳的分离度。与糖类衍生物类似，流动相组成对唾液酸衍生物在C18柱上的保留影响十分明显。流动相中有机相和水相的比例稍微发生变化均会影响3种唾液酸的出峰时间和分离度。因此梯度洗脱的前4 min流动相比例变化缓慢，待3种唾液酸全部出峰后，再提高乙腈比例以快速冲洗杂质，缩短分离时间。通过优化梯度洗脱程序可使Neu5Ac、Neu5Gc和KDN实现良好分离，在4 min内完全出峰，分离良好，峰形尖锐，且响应值较高。3种唾液酸混合标准溶液（0．02 μg/mL）的色谱图如图2所示。

图2 3种唾液酸混合标准溶液（0．02 μg/mL）的色谱图Fig．2 Chromatogram of 3 SAs mixed standard solution（0．02 μg/mL）

2.2 前处理条件的选择

2.2.1 酸解条件的优化研究表明酸水解唾液酸的作用强于酶解，且耗时更短，其中盐酸的水解效果较好［27-28］。盐酸酸解的一般条件是在0．1 mol/L盐酸中80℃水解2 h，Ye等［19］研究表明，奶粉样品中唾液酸水解的最佳条件为0．6 mol/L盐酸80℃水解14 min。因此实验以草鱼肉为基质，以3种唾液酸含量为指标，比较了唾液酸在80℃下0．1 mol/L盐酸水解2 h以及80℃下0．6 mol/L盐酸分别水解14、20、30、50 min 5种条件下的水解效率。向处理好的草鱼样品中加入30 μg/g标准溶液，每个酸解条件做3个平行。结果表明，草鱼肉经0．6 mol/L盐酸水解20 min后3种唾液酸的含量达到最大，随着时间延长，唾液酸的含量明显降低，表明20 min时唾液酸已降解完全，而反应时间过长会使得单体结构不稳定的唾液酸发生降解。因此，选择酸解条件为80℃下0．6 mol/L盐酸水解20 min。

2.2.2 衍生条件的优化唾液酸的衍生试剂包括邻苯二胺类、苯胺类、甲基化试剂碘甲烷、烷基胺类试剂等。其中邻苯二胺类试剂DMB具有荧光信号强、灵敏度高等优势，但DMB衍生方法也存在缺点［29］：DMB及其衍生物具有光敏感性，暴露在空气中易被氧化变色，自然光室温下超过24 h即不稳定，必须避光-20℃冷冻保存，不利于大批量样品的检测和储存，因此配制衍生试剂中常会加入连二亚硫酸钠和β-巯基乙醇等还原剂使其稳定。但β-巯基乙醇具有较强烈的刺激性气味，连二亚硫酸钠有毒，对眼睛、呼吸道黏膜有刺激性，导致DMB衍生试剂具有非常刺激的气味，不利于人体健康。DMBA与DMB同属邻苯二胺类衍生试剂［30］，但前者更稳定，无需还原试剂辅助，且在唾液酸异构体的分离方面具有更好优势［31］。本实验选择DMBA作为衍生试剂，以草鱼肉样品为考察对象，3种物质的含量为指标，考察了样品溶液和DMBA衍生溶液的体积比（9∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2）、衍生反应温度（50、60、70℃）和衍生时间（30、60、90、120 min）3个因素对DMBA衍生效果的影响（图3）。

如图3所示，优化后选择的衍生条件为：样品溶液和DMBA衍生溶液的体积比为1∶1，反应温度为60℃，反应时间为60 min。在该条件下的衍生效果与DMB的衍生效果相近。

图3 样品溶液和DMBA衍生试剂的体积比（A）、衍生反应温度（B）、衍生反应时间（C）对唾液酸释放量的影响Fig．3 Effects of volume ratio of sample solution to DMBA derived reagent（A），derivative reaction temperature（B）and derivative reaction time（C）on sialic acid release

2.3 线性范围与定量下限

将3种分析物的混合标准溶液配制成质量浓度分别为0．02、0．05、0．1、0．2、0．5、1．0、2．0、5．0 μg/mL的标准工作溶液，采用本方法进行衍生和测定，以3种物质的色谱峰面积（y）对其质量浓度（x，μg/mL）进行线性回归，绘制标准曲线。结果表明，Neu5Ac、Neu5Gc和KDN在0．02~5．0 μg/mL范围内线性良好，相关系数（r2）均大于0．999（见表1）。因鱼肉中KDN的含量比其他2种物质低1个数量级［24-25］，为得到更加准确的含量，实际样品检测和含量计算中Neu5Ac、Neu5Gc的测定以0．1、0．2、0．5、1．0、2．0、5．0 μg/mL标准工作溶液绘制标准曲线；KDN的测定以0．02、0．05、0．1、0．2、0．5、1．0 μg/mL标准工作溶液绘制标准曲线。将3种唾液酸混合标准溶液稀释并衍生化后进行测定，以10倍信噪比计算得到Neu5Ac、Neu5Gc和KDN的定量下限（LOQ）分别为0．20、0．20、0．10 μg/g。

表1 3种唾液酸的线性关系、回收率和相对标准偏差（n=5）Table 1 Linear relations，recoveries and RSDs of 3 sialic acids（n=5）

2.4 方法回收率与相对标准偏差

分别以草鱼和大黄鱼空白样品为基质，加入低、中、高3个浓度水平的混合标准溶液，酸解后衍生，进行加标回收实验（表1）。结果表明，3种唾液酸的平均回收率为90．8%~103%，相对标准偏差（RSD）为2．8%~5．0%，方法精密度和准确度可满足检测要求。

2.5 实际样品分析

应用建立的方法测定了草鱼、鲫鱼、青鱼、黄姑鱼、鲈鱼、大黄鱼等常见淡水和海水鱼的Neu5Ac、Neu5Gc和KDN含量。结果显示，所测鱼肉中Neu5Ac的含量均较高，且远高于KDN的含量；Neu5Gc未检出。其中青鱼样品的Neu5Ac含量最高（见表2），色谱图见图4。

图4 青鱼样品的色谱图Fig．4 Chromatogram of a black carp sample

表2 实际样品中3种唾液酸的含量Table 2 Contents of 3 SAs in practical samples

3 结论

本文建立了DMBA衍生/超高效液相色谱测定鱼肉中3种核心唾液酸的方法，前处理中选择DMBA作为衍生试剂代替DMB，并对衍生条件进行了优化。该方法测定时间短，灵敏度高，精密度好，线性良好，已成功应用于鱼肉中唾液酸的测定。研究结果可为今后开展唾液酸的乙酰化、甲基化等多种同分异构体的分离和鉴定提供基础。