基于网络药理学和分子对接探究肠炎宁颗粒治疗功能性腹泻和腹泻型肠易激综合征的作用机制

田文国，陈金鹏，王春芳，刘 毅，盖晓红，刘全国，田成旺，陈常青

基于网络药理学和分子对接探究肠炎宁颗粒治疗功能性腹泻和腹泻型肠易激综合征的作用机制

田文国1, 2，陈金鹏2, 3, 4，王春芳1, 2，刘 毅2, 3, 4，盖晓红2, 3, 4，刘全国5，田成旺2, 3, 4*，陈常青2, 3, 4*

1. 天津中医药大学，天津 301617 2. 天津药物研究院，天津 300462 3. 天津市中药质量标志物重点实验室，天津 300462 4. 释药技术与药代动力学国家重点实验室，天津 300462 5. 海南葫芦娃药业集团股份有限公司，海南 海口 570216

运用网络药理学和分子对接方法探究肠炎宁颗粒治疗功能性腹泻（functional diarrhea，FD）和腹泻型肠易激综合征（diarrhea irritable bowel syndrome，IBS-D）的作用机制。通过TCMSP数据库、文献检索肠炎宁颗粒5味药材的成分；SwissADME平台筛选肠炎宁颗粒活性成分；SwissTargetPrediction平台反向靶标预测肠炎宁颗粒活性成分作用靶点；GeneCards数据库预测FD和IBS-D靶点；Venny 2.1.0获取肠炎宁颗粒治疗FD和IBS-D的交集靶点；STRING数据库获取蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络后导入Cytoscape 3.9.1软件获取核心靶点；OmicsBean数据库对核心靶点进行基因本体（gene ontology，GO）功能和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析；Cytoscape 3.9.1软件构建“药材-活性成分-靶点”及“关键活性成分-核心靶点-通路”网络；Schrödinger-Maestro对关键活性成分和核心靶点进行分子对接。从肠炎宁颗粒中筛选得到治疗FD和IBS-D的活性成分30个，其中10个关键活性成分为甲基异茜草素、槲皮素、4′,5-二羟基黄酮、山柰酚、鞣花酸、焦性没食子酸、金圣草黄素、咖啡酸、木犀草素、芹菜素；24个核心靶点为蛋白激酶B1（protein kinase B1，AKT1）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）、MMP9等。KEGG通路富集分析发现其主要涉及内分泌抵抗、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路、前列腺癌等通路。分子对接表明关键活性成分与核心靶点均可自发结合。肠炎宁颗粒可能通过多成分、多靶点和多通路，降低内脏敏感、减少炎性反应、调节肠道菌群，从而治疗FD和IBS-D。

肠炎宁颗粒；功能性腹泻；腹泻型肠易激综合征；网络药理学；甲基异茜草素；槲皮素；4′,5-二羟基黄酮；山柰酚；鞣花酸；焦性没食子酸；金圣草黄素；咖啡酸；木犀草素；芹菜素

功能性腹泻（functional diarrhea，FD）是临床上消化系统常见的一种疾病，以持续性或反复发作性水样便或松散便，腹痛或腹胀症状不明显，排便次数增多为主要临床特征[1]。腹泻型肠易激综合征（diarrhea irritable bowel syndrome，IBS-D）作为肠易激综合征的1个亚型，是一种表现为反复发作的腹痛并伴随腹泻的疾病[2]。FD和IBS-D的发生都不具有典型的胃肠道器质性病变，一般FD患者以腹泻为主而腹痛为次，IBS-D患者以腹痛为主而腹泻轻微[3]。FD与IBS-D具有病情复杂、病程较长、迁延难愈的特点，长期患病对患者生活、工作造成了极大影响，且两者在病情发展的过程中可相互转化[4]。目前临床治疗FD与IBS-D主要以止泻、止痛为主，但疗效欠佳，且不良反应多，无法长期使用，因此亟需疗效确切的治疗药物。

中药治疗疾病具有多成分、多靶点、多通路的特点，其临床疗效显著。肠炎宁颗粒为现代中药制剂，主要由金毛耳草、地锦草、樟树根、枫树叶、香薷组成，其中金毛耳草为君药，性平味苦，具有清热祛湿、止泻的功效；地锦草与枫树叶均为臣药，可增强君药的功效，并能起到清热解毒、利湿止泻的作用；樟树根具有祛风止痛的功效；香薷具有祛湿和中的功效，诸药合用便可起到清热利湿、行气的功效[5]。现代医学研究发现[6]，上述5味中药中含有多种有效成分，包括黄酮类、环烯醚萜苷、鞣质类等，这些成分具有抗菌、抗炎、止血、抗氧化、增强免疫力等作用。但目前关于肠炎宁颗粒治疗FD与IBS-D的作用机制尚不明确，相关研究亦不多见。

网络药理学这一概念由英国Hopkins教授于2007年提出[7]，近些年已成为中药药效物质基础与作用机制研究的热门工具[8-10]。网络药理学可基于系统生物学理论研究药物，从多成分、多靶点、多通路探究药物的作用机制，通过网络药理学不同层次的网络构建，建立“药材-成分-靶点-通路”的网络模型，在揭示中药复方的复杂作用机制方面起着重要作用，可全面研究复杂药物对疾病的影响和干预。因此，本研究通过网络药理学和分子对接技术初步探讨肠炎宁颗粒治疗FD与IBS-D的作用机制，以期为肠炎宁颗粒治疗FD与IBS-D的进一步研究及临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 肠炎宁颗粒中药材成分库的建立

肠炎宁颗粒由金毛耳草、地锦草、樟树根、枫香树叶、香薷5味中药组成。利用TCMSP数据库（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）[11]筛选地锦草、香薷2味中药的成分，对于TCMSP数据库中未收录的金毛耳草、樟树根及枫香树叶通过相关参考文献，查找其所含成分。

1.2 肠炎宁颗粒活性成分及靶点筛选

通过Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih. gov/）数据库[12]检索肠炎宁中药成分的Canonical SMILES结构，将中药成分的Canonical SMILES结构导入SwissADME平台（http://www.swissadme.ch/）[13]进行口服生物利用度及类药性分析。将Pharmacokinetics项下GI absorption满足High，同时Druglikeness项下Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge满足2个Yes以上的成分作为候选活性成分，将候选活性成分的Canonical SMILES结构导入SwissTargetPrediction平台（http://www. swisstargetprediction.ch/）[14]，选择物种为“Homo sapiens”，条件设为“Probability＞0.3”，进行肠炎宁颗粒候选活性成分靶点预测。

1.3 FD和IBS-D疾病靶点预测

在GeneCards（https://www.genecards.org/）[15]数据库中以“diarrhea irritable bowel syndrome”和“functional diarrhea”为关键词检索疾病相关的靶点，取Relevance score＞4作为FD和IBS-D候选疾病靶点。

1.4 肠炎宁颗粒治疗FD和IBS-D的“药材-活性成分-靶点”网络构建

将在GeneCards数据库中检索得到的FD和IBS-D靶点与肠炎宁颗粒候选靶点在Venny 2.1.0（https:// bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）[16]中生成韦恩图，映射筛选出共同靶点。根据“肠炎宁颗粒5味中药材”“肠炎宁颗粒活性成分”以及“肠炎宁颗粒活性成分治疗FD和IBS-D的作用靶点”，在Excel表格中建立“药材-活性成分”“活性成分-靶点”的相互对应关系，导入Cytoscape 3.9.1软件中构建肠炎宁颗粒治疗FD和IBS-D的“药材-活性成分-靶点”网络。

1.5 蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建及核心靶点筛选

为探究肠炎宁颗粒相关靶点与FD和IBS-D的相互作用，将交集靶点导入String数据库（https://cn. stringdb.org/cgi/input?sessionId=bgKEhiAlcSw4& input_ page_show_search=on）[17]，物种设置为“Homo Sapiens”，构建PPI网络，设定置信度为0.9，隐藏游离靶标，下载TSV格式文件并导入Cytoscape 3.9.1，绘制PPI网络图。运用“Network Analyze”进行拓扑参数分析，根据节点连接度值＞中位数筛选核心靶点。

1.6 基因本体（gene ontology，GO）功能和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

运用Omicsbean平台（http://www.omicsbean. cn/）[18]对肠炎宁颗粒治疗FD和IBS-D核心靶点进行GO功能以及KEGG通路富集分析。GO功能富集分析主要包括生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）以及分子功能（molecular function，MF），筛选GO功能富集分析前10项结果制成柱状图进行可视化；筛选KEGG通路富集分析前10条通路制成气泡图进行可视化。

1.7 肠炎宁颗粒“关键活性成分-核心靶点-通路”网络构建

根据肠炎宁颗粒治疗FD和IBS-D的核心靶点所对应的关键活性成分以及核心靶点做KEGG富集通路预测结果，在Excel表格中建立“关键活性成分-核心靶点”和“核心靶点-通路”的相互对应关系，导入Cytoscape 3.9.1软件中构建肠炎宁颗粒治疗FD和IBS-D的“关键活性成分-核心靶点-通路”网络。

1.8 分子对接

关键活性成分作为小分子配体，通过PubChem数据库搜索关键活性成分CAS号，从Chem3D19.0中导出，对其执行能量最低计算保存为mol2格式。核心靶点作为受体，从Protein Data Bank（PBD）数据库（https://www.rcsb.org/）[19]下载核心靶点蛋白的PDB格式三维结构（核心靶点蛋白遵循：人源蛋白，分辨率及优先选择具有原始配体）。将数据导入Schrödinger2020Maestro12.4软件对核心靶点蛋白去水与关键活性成分做分子对接。

2 结果

2.1 肠炎宁颗粒中药材活性成分

如表1所示，共筛选得到肠炎宁颗粒在SwissTargetPrediction平台有作用靶点的活性成分88个，金毛耳草5个、地锦草10个、樟树根6个、枫香树叶13个、香薷60个。其中金毛耳草、香薷含有共有活性成分1个，为槲皮素；地锦草、枫香树叶含有共有活性成分1个，为山柰酚；地锦草、香薷含有共有活性成分2个，为亚麻子油酸及软脂酸；樟树根、香薷含有共有活性成分2个，为桉叶油醇及黄樟素。

表1 肠炎宁颗粒中活性成分

续表1

2.2 肠炎宁颗粒治疗FD和IBS-D作用靶点筛选

通过将肠炎宁颗粒活性成分Canonical SMILES结构导入SwissTargetPrediction平台，选择物种为“Homo sapiens”，条件设为“Probability＞0.3”，预测得到了不重复的靶点共计171个。通过Genecards数据库以“functional diarrhea”为关键词搜索到Relevance score＞4的相关靶点2007个，以“diarrhea irritable bowel syndrome”为关键词搜索到Relevance score＞4的相关靶点1970个，将在Genecards数据库中检索得到的FD和IBS-D靶点与肠炎宁颗粒全方候选靶点在Venny 2.1.0中生成韦恩图，映射筛选出77个共有靶点，作为肠炎宁颗粒治疗FD和IBS-D的作用靶点，见图1。

图1 肠炎宁颗粒治疗FD和IBS-D靶点的Venn图

2.3 肠炎宁颗粒“药材-活性成分-靶点”网络构建

利用Cytoscape 3.9.1软件处理得到“药材-活性成分-靶点”网络，见图2，运用“Network Analyze”进行拓扑分析，该网络有112个节点、282条边，各节点表示药材、成分、靶点，各节点间的边代表“药材-成分”“成分-靶点”之间的对应关系，网络中平均相邻节点数为5.212，网络密度0.051，网络异质性为1.504，网络中心度0.424。表明肠炎宁颗粒治疗FD和IBS-D是基于多成分、多靶点的复杂协同作用。

2.4 药物与疾病靶点交集PPI分析

将肠炎宁颗粒治疗FD与IBS-D的77个作用靶点输入STRING数据库，进行PPI网络构建，设定置信度为0.9，隐藏游离靶标，下载TSV格式文件并导入Cytoscape 3.9.1，绘制PPI网络图见图3。运用“Network Analyze”进行拓扑分析，发现此网络中共有55个节点，130条边，节点代表靶点，每条边则代表靶点互作关系，节点的大小与颜色代表靶点的度值，节点越大，颜色越深，表明作用越关键。以节点连接度值＞中位数为核心靶点，经计算度值中位数为4，其中原癌基因酪氨酸蛋白激酶（proto-oncogene tyrosine-protein kinase，SRC）、磷脂酰肌醇-3激酶调节亚基1（phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1，PIK3R1）、雌激素受体1（estrogen receptor，ESR1）、酪氨酸激酶Fyn（tyrosine kinase Fyn，FYN）、蛋白激酶B1（protein kinase B1，AKT1）、细胞周期蛋白依赖激酶1（cyclin dependent kinase 1，CDK1）、蛋白酪氨酸激酶2（protein tyrosine kinase 2，PTK2）、糖原合成酶激酶3B（glycogen synthase kinase 3B，GSK3B）、细胞周期蛋白A2（cyclin A2，CCNA2）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、CDK4、CDK6、CCND1、极光激酶A（aurora kinase A，AURKA）、血小板衍生生长因子受体（platelet-derived growth factor receptor，PDGFRB）、CDK2、淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase，PIK3CG）、拓扑异构酶2α（topoisomerase 2α，TOP2A）、erb-b2受体酪氨酸激酶2（erb-b2 receptor tyrosine kinase 2，ERBB2）、基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）、MMP9、激酶插入域受体（kinase insert domain receptor，KDR）、脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，SYK）24个核心靶点的度值中位数值大于4。

图3 肠炎宁颗粒治疗FD和IBS-D潜在作用靶点PPI网络

2.5 GO功能富集分析

利用OmicsBean分析平台对24个核心靶点进行GO功能注释分析，共得BP 285个条目（＜0.05），CC 270个条目（＜0.05），MF 225个条目（＜0.05），按值排序，选取排名前10的项目进行可视化展示，绘制GO功能注释分析柱状图，见图4。其中，BP主要涉及大分子代谢过程的正调控、对含氧化合物的反应等；CC主要涉及细胞质基质、细胞核等；MF主要涉及激酶活性、作用于蛋白质的催化活性等。

图4 肠炎宁颗粒治疗FD和IBS-D的核心靶点GO功能富集分析(前10)

2.6 KEGG通路富集分析

利用OmicsBean分析平台对24个核心靶点进行KEGG通路富集分析，共获得105条信号通路（＜0.05），选取排名前10的通路进行可视化处理，绘制KEGG信号通路气泡图，见图5。其中rich factor表示相关基因中位于该通路的基因数目与所有注释基因中位于该通路的基因总数的比值，该值越大代表富集程度越高。分析富集的通路发现，主要有内分泌抵抗通路、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路等。

2.7 肠炎宁颗粒“关键活性成分-核心靶点-通路”网络构建

根据24个核心靶点对应出具有治疗FD和IBS-D的肠炎宁颗粒关键活性成分有10个，其中金毛耳草2个，为甲基异茜草素、槲皮素；地锦草3个，为4′,5-二羟基黄酮、山柰酚、鞣花酸；枫香树叶2个，为焦性没食子酸、山柰酚；香薷5个，为金圣草黄素、咖啡酸、木犀草素、芹菜素、槲皮素。金毛耳草和香薷含有共有成分1个，为槲皮素；地锦草和枫香树叶含有共有成分1个，为山柰酚。利用Cytoscape 3.9.1软件得到肠炎宁颗粒24个核心靶点的“关键活性成分-核心靶点-通路”网络，见图6。运用“Network Analyze”进行拓扑分析，该网络有139个节点、576边，网络中各节点代表关键活性成分、核心靶点、信号通路，各节点间边表示“关键活性成分-核心靶点”“核心靶点-通路的相互作用”，网络中平均相邻节点数为8.259，网络密度为0.060，网络异质性为1.437，网络中心度为0.579，网络结果显示存在1个分子与多个核心靶点蛋白的相互作用，也存在不同分子作用于同1个靶点蛋白的现象，同时也显示了1个核心靶点可对应多条信号通路，表明肠炎宁颗粒可能通过多成分、多靶点、多通路治疗FD与IBS-D，初步阐释了肠炎宁颗粒治疗FD与IBS-D的主要药效物质基础和作用机制。

图5 肠炎宁颗粒治疗FD和IBS-D的核心靶点KEGG通路富集分析(前10)

图6 “关键活性成分-核心靶点-信号通路”网络

2.8 分子对接结果

利用Schrödinger2020Maestro12.4软件将10个关键活性成分（甲基异茜草素、槲皮素、4′,5-二羟基黄酮、山柰酚、鞣花酸、焦性没食子酸、金圣草黄素、咖啡酸、木犀草素、芹菜素）与PPI网络图中24个核心蛋白（SRC、PIK3R1、ESR1、FYN、AKT1、CDK1、PTK2、GSK3B、CCNA2、EGFR、CDK4、CDK6、CCND1、AURKA、PDGFRB、CDK2、APP、PIK3CG、TOP2A、ERBB2、MMP2、MMP9、KDR、SYK）进行分子对接。配体和受体结合能越低，结合越稳定，发生作用的可能性越大，一般认为，结合能小于0表示两者间可以自发结合，小于−20.93 kJ/mol说明有较好的结合活性，小于−29.30 kJ/mol表示有强烈的结合活性[20]。如表2所示，10个关键活性成分和24个核心蛋白均可以自发结合。其中木犀草素与16个核心靶点有强烈的结合活性，甲基异茜草素与15个核心靶点有强烈的结合活性，槲皮素与15个核心靶点有强烈的结合活性，鞣花酸与15个核心靶点有强烈的结合活性，芹菜素与14个核心靶点有强烈的结合活性，山柰酚与14个核心靶点有强烈的结合活性，4′,5-二羟基黄酮与13个核心靶点有强烈的结合活性，咖啡酸与6个核心靶点有强烈的结合活性。选取10个关键活性成分与各自对应打分最高的核心蛋白可视化，其结合模式见图7。甲基异茜草素与CDK4通过氢键作用和氨基酸残基VAL A:83结合，通过疏水键与PHE A:80结合，结合能为−40.17 kJ/mol；槲皮素与KDR通过氢键作用和氨基酸残基CYS A:919、GLU A:917、ASP A:1046结合，结合能为−44.77 kJ/mol；4′,5-二羟基黄酮与KDR通过氢键作用和氨基酸残基APS A:1046结合，通过疏水键与PHE A:1047结合，结合能为−41.00 kJ/mol；山柰酚与KDR通过氢键作用和氨基酸残基CYS A:919、GLU A:917、ASP A:1046结合，通过疏水键与PHE A:1047结合，结合能为−46.02 kJ/mol；鞣花酸与CDK4通过氢键作用和氨基酸残基VAL A:83结合，结合能为−39.33 kJ/mol；焦性没食子酸与CDK2通过氢键作用和氨基酸残基LEU A:83结合，结合能为−28.03 kJ/mol；金圣草黄素与KDR通过氢键作用和氨基酸残基CYS A:919、ASP A:1046结合，结合能为−43.93 kJ/mol；咖啡酸与TOP2A通过氢键作用和氨基酸残基GLY B:164、MG B:904、ARG B:162、LYS B:378、SER B:149结合，结合能为−40.58 kJ/mol；木犀草素与KDR通过氢键作用和氨基酸残基CYS A:919、ASP A:1046结合，结合能为−45.19 kJ/mol；芹菜素与KDR通过氢键作用和氨基酸残基ASP A:1046结合，通过疏水键与PHE A:1047结合，结合能为−45.19 kJ/mol。

表2 肠炎宁颗粒治疗FD和IBS-D的关键活性成分与核心蛋白结合能

图7 10个关键活性成分与各自对应打分最高的核心靶点分子对接

3 讨论

近年来，FD和IBS-D等肠病已成为我国乃至全球范围内的流行病，严重降低了患者生活质量，同时也增加了其经济负担，且目前FD和IBS-D的病因和发病机制尚未完全明确。研究认为FD和IBS-D是性别、年龄、遗传、免疫、环境等因素及其相互叠加作用的结果[21-23]。现代医学认为心理因素、免疫功能异常、内脏高敏感性、肠道菌群失调、消化系统感染、脑肠轴、自主神经功能与其发病相关[24-25]，现在常用抗生素、吸附剂和调节肠道内环境等方式治疗FD和IBS-D，短期疗效尚可，但停药后复发率高且不良反应明显[26-28]。中医学认为FD和IBS-D的发病的病因主要为外邪侵袭及饮食内伤，同时情志不遂、劳倦及久病体虚等也是重要影响因素[29-30]。肠炎宁颗粒属于中成药，具有清热利湿、止泻行气的功效[31]，常用于治疗FD和IBS-D等肠性疾病，但其作用机制尚无系统性研究。

本研究运用网络药理学和分子对接技术探索肠炎宁颗粒治疗FD和IBS-D的作用机制，以口服生物利用度和类药性为筛选标准，共得到肠炎宁颗粒活性成分88个，根据“药材-成分-靶点”网络分析筛选出肠炎宁颗粒治疗FD和IBS-D的活性成分30个及作用靶点77个，根据“关键活性成分-核心靶点-通路”网络分析，最终拟合肠炎宁颗粒治疗FD和IBS-D的主要活性成分有甲基异茜草素、槲皮素、4′,5-二羟基黄酮、山柰酚、鞣花酸、焦性没食子酸、金圣草黄素、咖啡酸、木犀草素、芹菜素。槲皮素是一种天然的黄酮醇，具有抗炎镇痛、抗氧化、抗癌和抗菌等多种生物活性[32-33]。5-羟色胺作为一种广泛存在人体中枢神经及胃肠道中的脑肠肽，参与内脏疼痛及胃肠道动力，与FD和IBS-D与密切相关[34]。研究表明，槲皮素可降低结肠5-羟色胺水平，减轻炎症诱导型肠易激综合征大鼠的内脏高敏感性及内脏运动反应[35]；槲皮素可通过增强细胞间紧密连接，调节肠道免疫反应，维系肠道微生态稳定，进而保护肠道黏膜屏障功能[36]。山柰酚是一种黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化以及抗癌等作用[37-38]。研究发现，槲皮素和山柰酚均可通过调控Ca2+通道，抑制大鼠结肠纵肌的自发收缩，进而达到解痉作用[39]。鞣花酸是一种广泛存在于植物中的天然多酚，大量文献报道鞣花酸在清除自由基、抗突变、抗肿瘤、抗菌、抗过敏、抗衰老以及抗氧化等方面有突出作用[40-41]。鞣花酸对肠道上皮细胞具有显著的保护作用，能够促进肠道内容物中营养物质的吸收，防止肠道中的致病菌在肠道上皮细胞中定殖[42]，而且其最大优点是其作为亲营养素的一种，不影响肠道菌群，并且没有停药期[43]。此外，鞣花酸还可通过降低血液炎症因子表达，进而产生改善小肠上皮细胞炎症水平[44]。木犀草素是一种具有多种药理活性的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抑菌等活性[45-46]。研究表明，木犀草素在调节肠道免疫系统和治疗慢性炎症性肠病中起着重要作用，可以减少小肠内容物的体积和重量，从而发挥止泻作用[47-48]。在10个主要活性成分中，金毛耳草占2个，地锦草占3个，枫香树叶占2个，香薷占5个，由此推测金毛耳草、地锦草、枫香树叶和香薷可能是肠炎宁颗粒治疗FD和IBS-D的核心中药。

通过构建PPI网络图，筛选得出肠炎宁颗粒治疗FD和IBS-D的核心靶点有SRC、PIK3R1、ESR1、FYN、AKT1、PTK2、GSK3B、EGFR、MMP2、MMP9等，体现出了中药治疗的多靶点特点。AKT1作为Akt的亚型，可参与免疫、代谢、生殖等多种生物过程[49]，研究表明，Akt是治疗肠易激综合征的焦点分子，而AKT1作为Akt的同源基因，推测其应与肠易激综合征有密切联系[50-51]。MMP2和MMP9在炎症因子表达等方面起着重要作用，有研究显示MMP2和MMP9在肠道局部损伤和肠道炎症中表达水平显著升高[52]。

GO功能富集结果显示肠炎宁颗粒作用于FD和IBS-D的核心靶点影响生物过程主要包括大分子代谢过程的正调控、对含氧化合物的反应、蛋白质磷酸化、动物器官发育、对有机物质的反应、细胞对有机物质的反应、氮化合物代谢过程的正调控、对内源性刺激的反应、转移酶活性的反应、对氮化合物的反应等，表明这些生物过程可能在FD和IBS-D的发生和发展中体现了重要作用。

KEGG通路富集分析结果显示，内分泌抵抗、PI3K/Akt、前列腺癌、癌症、膀胱癌等通路可能是肠炎宁颗粒治疗FD和IBS-D的潜在信号通路。EGFR可介导PI3K/Akt信号通路，在细胞凋亡和细胞发育中起关键作用[53]。PI3K是细胞内磷脂酰肌醇的激酶，激活后的PI3K通过质膜上产生的第2信使磷脂酰肌醇三磷酸与细胞内含有PH结构域的信号蛋白Akt结合，从Akt转移至细胞膜并改变其构象。研究表明，可通过抑制PI3K/Akt信号通路的活化，从而减轻肠道炎症反应，达到保护肠道黏膜的作用[54]。

分子对接结果显示，肠炎宁颗粒的10个主要活性成分与24个核心靶点平均结合能为−29.30 kJ/mol，结合能力最高的为KDR与山柰酚，结合能为−46.02 kJ/mol；结合能力最低的为CCND1与山柰酚，结合能为−15.48 kJ/mol，表明肠炎宁颗粒主要活性成分和核心受体蛋白可稳定结合，其中KDR、SRC、TOP2A、CDK4、SYK与主要活性成分对接结果较好，提示其可能为肠炎宁颗粒治疗FD和IBS-D关键靶点。

综上所述，本研究发现，肠炎宁颗粒主要活性成分甲基异茜草素、槲皮素、4′,5-二羟基黄酮、山柰酚、鞣花酸、焦性没食子酸、金圣草黄素、咖啡酸、木犀草素、芹菜素等可能通过与SRC、PIK3R1、ESR1、FYN、AKT1、PTK2、GSK3B、EGFR、MMP2、MMP9等蛋白相结合，进一步调节内分泌抵抗、PI3K/Akt、前列腺癌、癌症、膀胱癌、EGFR酪氨酸激酶抑制剂抵抗等通路，从而增强肠屏障功能、降低内脏敏感、减少炎性反应、调节肠道菌群等治疗FD和IBS-D。从系统生物学角度对肠炎宁颗粒治疗FD和IBS-D的作用机制进行预测结果的分析，符合中医运用复方中药多靶点、多途径、多系统，整体调理机体、防治疾病的特点，但网络药理学研究方法存在一定的局限性，本研究作为一种预测，是在分子机制层面并结合参考文献进行的预测探讨，后期仍需采用实验验证的方法进一步验证理论分析的准确性。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Mechanism of Changyanning Granules in treatment of functional diarrhea and diarrhea irritable bowel syndrome based on network pharmacology and molecular docking

TIAN Wen-guo1, 2, CHEN Jin-peng2, 3, 4, WANG Chun-fang1, 2, LIU Yi2, 3, 4, GAI Xiao-hong2, 3, 4, LIU Quan-guo5, TIAN Cheng-wang2, 3, 4, CHEN Chang-qing2, 3, 4

1. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China 2. Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300462, China 3. Tianjin Key Laboratory of Quality Marker of Traditional Medicine, Tianjin 300462, China 4. State Key Laboratory of Drug Delivery and Pharmacokinetics, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300462, China 5. Hainan Huluwa Pharmaceutical Group Co., Ltd., Haikou 570216, China

To explore the mechanism of Changyanning Granules (肠炎宁颗粒) in treatment of functional diarrhea (FD) and diarrhea irritable bowel syndrome (IBS-D) by using network pharmacology and molecular docking.The ingredients of five medicinal materials from Changyanning Granules were searched by TCMSP database and literature. SwissADME platform was used to screen the active ingredients of Changyanning Granules; SwissTargetPrediction platform was used to predict the targets of active ingredients of Changyanning Granules; GeneCards database was used to predict FD and IBS-D targets; Venny 2.1.0 was used to collect the intersection targets of Changyanning Granules in treating FD and IBS-D; STRING database was used to acquire protein-protein interaction (PPI) network and then import into Cytoscape 3.9.1 software to acquire the core targets; OmicsBean database was used to carry out gene ontology (GO) function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis on core targets; “Medicinal material-active ingredient-target” and “key active ingredient-core target-pathway” networks were constructed by Cytoscape 3.9.1 software; Schrödinger-Maestro was used to perform molecular docking between key active components and core targets.Thirty active ingredients for treating FD and IBS-D were screened from Changyanning Granules, among which 10 key active ingredients were rubiadin, quercetin, 4′,5-dihydroxyflavone, kaempferol, ellagic acid, pyrogallol, chrysoeriol, caffeic acid, luteolin and apigenin. 24 core targets were protein kinase B1 (AKT1), epidermal growth factor receptor (EGFR), matrix metalloproteinase 2 (MMP2), MMP9, etc. KEGG pathway enrichment analysis found that it mainly involved endocrine resistance, phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt) signaling pathway, prostate cancer and other pathways. Molecular docking indicated that key active ingredients could spontaneously combine with core targets.Changyanning Granules may reduce visceral sensitivity, reduce inflammatory reaction and regulate intestinal flora through multiple components, multiple targets and multiple pathways, so as to treat FD and IBS-D.

Changyanning Granules; functional diarrhea; diarrhea irritable bowel syndrome; network pharmacology; rubiadin; quercetin; 4′,5-dihydroxyflavone; kaempferol; ellagic acid; pyrogallol; chrysoeriol; caffeic acid; luteolin; apigenin

R285.5

A

0253 - 2670(2022)22 - 7135 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.22.017

2022-09-06

中-德中药与植物药创新研发国际合作基地医药国际合作专项（0610-2140NF020630）

田文国，硕士研究生，研究方向为药物分析与质量标志物。E-mail: tian_wen_guo@163.com

田成旺，博士，研究员，主要从事中药新药研发及中药质量标准、药效物质基础研究。E-mail: tiancw@tjipr.com

陈常青，研究员。E-mail: chencq@tjipr.com

[责任编辑 李亚楠]