百香果酵素自然发酵过程中代谢产物及抗氧化活性研究

蒋家璇，韩盼盼，孔振杨，程陆陆，姚沛琳

（宿州学院生物与食品工程学院，安徽宿州 234000）

0 引言

食用植物酵素是以新鲜蔬菜、水果、药食两用本草类为原料，由多种微生物经过较长时间发酵得到的功能性发酵产品[1]。据报道，食用植物酵素可以有效清除体内过多的活性氧自由基，当自由基积累过多时，会对机体内的蛋白质、核酸等造成损伤，从而引发细胞的结构被破坏，甚至引发细胞突变[2]。在预防和治疗因自由基诱发的疾病和抗衰老方面具有广阔的应用前景[3-4]。

百香果分布于热带、亚热带地区，是一种重要的药食同源类植物，常作为民间传统药材使用[5-6]。百香果中含有的酚类化合物种类和含量较多，如黄酮类、黄酮醇类及酚类、酸类等[7]。百香果由于具有良好的风味特征，已在饮料加工中广泛使用，受到广大消费者的喜爱。但是，目前对于百香果的加工依然是初级加工模式，制作成百香果风味饮料或果干，因此可以借助酵素这种高营养价值的产品，增加百香果的附加价值，实现百香果产业的转型升级[8]。

目前，食用植物酵素品类繁多，发酵周期长，品质差别较大，而且缺少相关科学支撑。因此，亟需对食用植物酵素发酵过程中的重要的代谢产物变化和功能特性进行深入研究[9-10]。以百香果为原料，采用自然发酵方法制备百香果酵素，探究发酵过程中总糖、总酸、总酚等活性成分的变化规律，并以DPPH、羟基和ABTS 自由基清除率及还原力为指标，研究体外抗氧化活性的变化规律，为百香果酵素的精准发酵控制提供科学依据和理论基础，用标准化手段规范传统工艺，缩短发酵周期，保证酵素品质。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

新鲜百香果、单晶冰糖，购自宿州大润发超市。

1.1.2 主要试剂

氢氧化钠、酚酞、蒽酮、浓硫酸、没食子酸、福林酚（10%）、碳酸钠、无水乙醇、抗坏血酸、过氧化氢、水杨酸钠、硫酸亚铁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁，国药集团提供；标准葡萄糖溶液、1,1 -二苯基-2 -三硝基苯肼、ABTS 自由基清除能力检测试剂盒，上海源叶生物科技有限公司提供。

1.2 仪器与设备

SHP-400FE 型生化培养箱，上海三发科学仪器有限公司产品；Multiskan Go 酶标仪，美国Thermo公司产品；1-1SPK 小型台式冷冻离心机（Sigma）、pH 计（希玛仪表）、BSA124S 型电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司产品；JRA-6 型数显磁力搅拌水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司产品；SW-CJ-1CU 型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司产品；GI100T 型灭菌锅，致微仪器有限公司产品；玻璃发酵罐（居元素）。

1.3 试验方法

1.3.1 百香果酵素的制备

用超纯水清洗百香果表面杂质，自然沥干水分，将试验器材进行灭菌，百香果与糖质量比为1∶1，混匀密封，避光室温发酵。在发酵过程中，每天同一时间进行放气15 min、搅拌，观察发酵情况。在发酵的第0 天，第10 天，第20 天，第30 天，第40 天，第50 天，第60 天取样，将样品以转速10 000 r/min离心6～8 min，取上清液待测[11]，于-20 ℃下保存，待测。

1.3.2 代谢产物的测定

（1）pH 值测定。利用pH 计测定发酵过程中pH值的变化[12]。

（2）总酸含量测定。根据GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定方法》[13]。

（3）总糖含量测定。用蒽酮-硫酸法来测定样品中的总糖含量[14]。

（4）总酚含量测定。GB/T 31740.2—2015 茶多酚的检测方法[15]。

1.3.3 抗氧化活性的测定

（1）DPPH 自由基清除能力的测定。参照范金波等人[16]的方法，对DPPH 自由基清除率进行测定。

（2）羟基自由基清除能力的测定。采用Fenton法[17]。

（3）ABTS 自由基清除能力的测定。采用ABTS自由基清除能力试剂盒，按照试剂盒提供的方法进行测定。

（4）还原力的测定。还原力测定以维C 作为参照[18]，先加入1 mL 不同浓度的样品液和pH 值为6.6的0.2 moL/L 的磷酸盐缓冲液2.5 mL，再加入1%铁氰化钾溶液2.5 mL，混合均匀。于50 ℃恒温反应20 min，随后加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL 终止反应，对停止反应的溶液进行离心处理。取2.5 mL 离心上清液、2.5 mL 超纯水、0.1%三氯化铁溶液0.5 mL混合均匀，室温静置反应10 min，于波长700 nm 处测其吸光度。

2 结果与分析

2.1 百香果发酵过程中pH 值与总酸含量的变化结果

百香果酵素不同发酵时间总酸、pH 值的变化见图1。

图1 百香果酵素不同发酵时间总酸、pH 值的变化

由图1 可知，在发酵前10 d，总酸含量变化不明显，pH 值迅速下降；当发酵10～20 d 时，总酸呈现增长趋势，pH 值呈缓慢降低的现象，主要因为自然发酵下乳酸菌、醋酸菌等微生物大量增殖，产生大量的酸性次级代谢产物；在发酵20～60 d，总酸含量逐渐上升，pH 值基本稳定。

2.2 百香果发酵过程中总糖含量的变化结果

葡萄糖标准曲线见图2。

由图2 可知，采用蒽酮-硫酸法建立标准曲线，相关系数为R2=0.998 7，在葡萄糖质量浓度为20～160 μg/mL，质量浓度和吸光度呈良好的线性关系。

图2 葡萄糖标准曲线

百香果酵素不同发酵时间总糖含量的变化见图3。

图3 百香果酵素不同发酵时间总糖含量的变化

由图3 可知，发酵前期（0～20 d），总糖含量迅速降低，一方面说明糖作为碳源被分解利用，微生物生长和代谢较快；另一方面说明百香果原料中的水分在高糖渗透压条件下，发酵液被稀释，导致总糖含量降低。发酵中期（20～40 d），总糖质量浓度从0.770 g/mL 下降到0.704 g/mL。发酵后期（40～60 d），总糖质量浓度处于先增加后降低最终趋于稳定的阶段，增加的原因可能是随着发酵液中糖质量浓度的降低，微生物开始利用代谢产物中的糖类，进而溶解在发酵液中。

2.3 百香果发酵过程中总酚质量浓度的变化结果

总酚标准曲线见图4，百香果酵素不同发酵时间总酚质量浓度的变化见图5。

图4 总酚标准曲线

由图4 可知，相关系数为R2=0.999 5，在没食子酸质量浓度10～60 μg/mL，质量浓度和吸光度呈良好的线性关系。由图5 可知，随着发酵时间的延长，总酚质量浓度呈现上升的趋势。在发酵50～60 d 时总酚含量迅速上升，可能是因为百香果中的酚类物质在此发酵阶段大量溶出，或者是因为微生物消耗原料中的某些成分合成酚类物质或者其他代谢物转化成酚类物质。在发酵第60 天时，达到最高值为0.9 mg/mL。

图5 百香果酵素不同发酵时间总酚质量浓度的变化

2.4 抗氧化活性分析

2.4.1 DPPH 自由基清除能力变化结果

百香果酵素不同发酵时间DPPH 自由基清除率的变化见图6。

图6 百香果酵素不同发酵时间DPPH 自由基清除率的变化

由图6 可知，随着发酵时间增加，0.5%的质量分数和1.0%的质量分数对DPPH 自由基的清除率的变化趋势相同，均呈现先增加再缓慢降低再增加的变化趋势。在发酵第50 天～第60 天时，DPPH 自由基的清除率呈现增大的趋势，可能与此阶段总酚的大量增加有关。当质量分数为0.5%时，在发酵的第30 天，清除率达到最大值为60.0%；当质量分数为1.0%时，在发酵的第40 天，清除率达到最大值为78.7%。因此，从DPPH 自由基清除率的变化趋势来看，百香果酵素发酵时间在30～40 d 为宜。

2.4.2 羟基自由基清除能力变化结果

百香果酵素不同发酵时间羟基自由基清除率的变化见图7。

图7 百香果酵素不同发酵时间羟基自由基清除率的变化

采用硫酸亚铁-过氧化氢体系产生羟基自由基，通过水杨酸钠对反应后的羟基自由基进行快速捕捉[20]。由图7 可知，随着发酵时间的延长，羟基自由基的清除率先增大后稳定。在发酵10～20 d，从37.5%增大到75.1%。在第20 天～第50 天时，呈缓慢上升然后趋于稳定。在第50 天～第60 天时，呈现缓慢下降的趋势，可能与微生物衰亡有关。因此达到某个节点后，延长发酵时间对羟基自由基的清除能力贡献不大。

2.4.3 ABTS 自由基清除能力变化结果

百香果酵素不同发酵时间ABTS 自由基清除率的变化见图8。

图8 百香果酵素不同发酵时间ABTS 自由基清除率的变化

由图8 可知，百香果酵素的ABTS 自由基清除能率保持在35%左右。随着发酵时间延长，基本上呈现先增加后降低的趋势，在发酵第50 天，达到最大值为39.5%。

2.4.4 百香果发酵过程中还原力的变化

百香果酵素在不同发酵时间还原力的变化见图9。

图9 百香果酵素在不同发酵时间还原力的变化

由图9 可知，在整个发酵周期，除发酵20～30 d，均呈现不断增大的趋势。在发酵40～60 d，增加幅度明显，吸光度从0.391 上升到0.565。与以上3 种抗氧化指标相比，还原力的变化趋势与其差别较大，是因为还原力是一个综合性指标，与多种抗氧化机制有关。

3 结论

通过对百香果酵素发酵过程中总酸、pH 值、总糖、总酚及4 个抗氧化指标的结果分析来看，百香果酵素的发酵可以分为3 个阶段：发酵初期（0～10 d），发酵中期（10～20 d），发酵末期（20～40 d）。因此，在发酵40 d 时，可以作为百香果酵素前发酵结束的依据，在该阶段，可以通过补加营养物质或者人工接种发酵微生物进行发酵调控。采用传统发酵技术制备百香果酵素，研究了主要代谢产物及抗氧化活性随着发酵时间的变化趋势，有必要开展代谢产物与抗氧化活性相关性分析及菌群的结构和变化，为百香果酵素精准发酵奠定理论基础。