植物乳杆菌发酵对咖啡渣的生物转化作用研究

徐倩倩，关捷心，康唐颖，塔西亚·阿布都沙拉木，赵延胜

（江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江 212013）

咖啡以独特的风味及其抗疲劳、提神的功能而受到消费者的广泛欢迎。据统计，全球咖啡的年产量近千万吨，世界咖啡消耗量比可可和茶叶大1 倍多，且仍以每年1.5 倍的速度增长[1]。而在咖啡饮品加工制备过程中会产生大量的咖啡渣，在咖啡烹煮过程中，用于饮用的物质量仅占咖啡总物质含量的0.2%，剩余的咖啡渣中仍含有大量营养、功能及风味物质[2]。目前，国内外的咖啡渣主要用作肥料和燃料处理，其二次利用的附加值不高，有的甚至作为废弃物直接丢弃，既浪费了大量资源，也为生态环境带来了不利的影响[3-4]。目前，对于咖啡渣中有效成分的研究一般多集中于单一组分的提取，如提取其中的多糖、多酚等物质，而采用微生物发酵的方式处理咖啡渣，进行食品或饮品开发等方面的研究报道相对较少。

已有研究表明，咖啡及其相关副产物可以作为乳酸菌的发酵培养基，不仅能够转化咖啡渣中的营养成分，且发酵过程有利于特征风味的形成。董红红等人[5]对云南小粒咖啡湿法发酵体系中的pH 值和8 种有机酸的含量变化进行了测定，并分离鉴定了发酵过程中的细菌种类。结果表明，在发酵过程中，pH 值变化整体呈下降趋势，且存在大量产果胶酶的细菌。魏敏等人[6]研究了桑肠杆菌发酵对咖啡提取物挥发性成分的影响，结果表明咖啡提取物经微生物发酵后香气成分改变大，具有咖啡特征香气的同时，带有浓郁坚果奶香等丰富香气，刺激性成分和苦涩感减少，香气品质提高。因此，以咖啡渣为研究对象，采用植物乳杆菌对其进行发酵处理，研究植物乳杆菌的生物转化作用对咖啡渣主要营养活性成分及其挥发性物质的影响，以期为进一步开展咖啡渣的生物加工及其产品开发提供一定的研究依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

ME802E 型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司产品；超净工作台，苏州净化设备有限公司产品；SPX-250B-G 型微电脑光照培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂产品；全自动灭菌锅，上海三申医疗器械有限公司产品；ZQTY-70N 型恒温摇床，上海知楚仪器有限公司产品；7200 型可见光分光光度计，上海天达仪器有限公司产品；BR4-I 型冷冻离心机，法国JOUAN 公司产品；TQ8040 型气相色谱三重四极杆串联质谱仪，配备有自动顶空固相微萃取进样系统，日本岛津公司产品。

菌种：植物乳杆菌：Lactobacillus plantarum dy-1（CGMCC NO.6016，下文缩写为L.plantarum dy-1），由实验室自行分离；咖啡渣，镇江乐颜咖啡提供；白砂糖等其他食品配料，购自当地超市，NaOH、福林酚等试剂，国药上海化学试剂有限公司提供；蛋白测定试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司提供。

1.2 样品制备及分析方法

1.2.1 咖啡渣发酵样品制备方法

（1）植物乳杆菌活化扩培。将1×107CFU/mL 的L.plantarum dy-1 活化2 次使活菌数达到1×109CFU/mL（34 ℃培养24 h）。将培养好的乳酸菌以转速5 000 r/min离心15 min，弃去上清液，加入上清液等体积的蒸馏水，混合均匀，待发酵使用。

（2）咖啡渣发酵样品的制备。参照课题组之前的方法进行发酵样品处理[7]，将咖啡渣烘干后，称取20 g，按1∶7 比例加入蒸馏水，将咖啡渣（W）∶水（V）∶植物乳杆菌（%）按一定比例于锥形瓶中混合均匀，用纱布将锥形瓶封口，于31 ℃下以转速150 r/min 恒温发酵，发酵后的样品以转速5 000 r/min离心20 min 后，取上清液对其进行成分分析。

1.2.2 咖啡渣发酵产物主要营养活性成分分析方法

发酵产物中的总酚含量测定采用福林酚法[8]，以没食子酸标准品作参照，发酵样品经稀释后取1 mL，加入5 mL 蒸馏水、75%N2CO3溶液3 mL 和福林酚溶液1 mL，将上述试剂在水浴45 ℃下反应1.5 h 后，测定波长765 nm 处吸光度。根据没食子酸标准曲线（Y=0.003 6X+0.017，R2=0.993 4），计算样品中总酚含量。

根据试剂盒说明书，采用考马斯亮蓝法测定发酵产物中蛋白质量浓度，用酶标仪测定反应产物于595 nm 处吸光度。用标准蛋白溶液（mg/mL）得标准曲线（Y=0.685 8X+0.006 9，R2=0.988 1），计算未知样品中的蛋白质量浓度。

1.2.3 咖啡渣发酵产物的挥发性成分分析方法

固相微萃取条件在李信等人[9]方法的基础上调整：准确称取5.0 g 样品和1.5 g 氯化钠至顶空瓶，放入自动样品盘中，40 ℃平衡1 min 后，40 ℃自动固相微萃取20 min，并进样至GC/MS 分析。气相色谱分析条件：进样口温度250℃，萃取头进样后解析5 min，载气为高纯氦，载气流速为1 mL/min，毛细管气相色谱柱DB-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm），程序升温条件如下：40 ℃维持2 min，5 ℃/min 速率升温至200 ℃，10 ℃/min 速率升温至240 ℃后，维持5 min。质谱分析条件：离子源为EI 源，温度230 ℃，能量70 eV，扫描模式为全扫描模式，扫描质量数范围为35～450。

1.3 数据处理方法

样品中主要成分测定结果采用GraphPad Prism 7.0 绘制并进行显著性分析，采用MetaboAnalyst 4.0处理GC/MS 包含化合物及其峰面积数据，并使用Microsoft Excel 2019 重新绘制导出的结果分析图，其中，以-1～1 的化合物标准值绘制热图，反映发酵过程中的相对含量变化。

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌发酵对咖啡渣主要成分的影响

植物乳杆菌发酵产物中总酚（a）及蛋白质量浓度（b）分析结果见图1。

图1 植物乳杆菌发酵产物中总酚（a）及蛋白质量浓度（b）分析结果

结合pH 值监测分析，单独添加植物乳杆菌后，B 组样品的pH 值并无显著变化，说明在不添加额外碳源的条件下，咖啡渣无法提供充足的营养成分供植物乳杆菌发酵，但由图1 可知，B 组样品产物中的蛋白质量浓度有所提升（图1（b）），说明在样品处理过程中，仍有部分微生物发酵作用，包括植物乳杆菌初始的发酵，以及咖啡渣中可能存在的微生物自然发酵，促进了咖啡渣中蛋白的溶出；但总酚质量浓度显著降低（图1（a）），说明在B 组处理过程中，相关的发酵作用对酚类物质可能存在利用或者转化等作用，导致酚类物质减少，具体机制仍需进一步研究。

通过补充蔗糖作为碳源，植物乳杆菌发酵作用明显，主要体现在发酵后pH 值显著降低，发酵产物的pH 值为4.3，并且由图1 可知，总酚及蛋白质量浓度均显著增加，说明植物乳杆菌发酵作用显著促进了咖啡渣中有效成分的释放，有助于通过发酵作用实现咖啡渣的生物转化及应用。

2.2 咖啡渣的植物乳杆菌发酵产物主要挥发性成分分析与鉴定

气相色谱/质谱总离子色谱流图见图2。

图2 气相色谱/质谱总离子色谱流图

由图2 可知，经自动固相微萃取-气相色谱/质谱分析后，样品中挥发性物质得到较好的分离，通过Nist 17 数据库软件的匹配、检索，对挥发性化合物进行初步鉴定，定性匹配度90 以上的化合物信息如表1 所示。结果显示，与A 组和B 组样品相比，C 组发酵样品中检出有乙酸糠酯、2-乙基-3-甲基吡嗪、3,5-二乙基-2-甲基-吡嗪等化合物。

2.3 植物乳杆菌发酵对咖啡渣挥发性成分的影响

将不同组样品化合物对应的色谱峰面积等信息进行处理，得到数据矩阵，经MetaboAnalyst 软件归一化处理后，进行主成分分析。

不同处理组样品主成分分析结果及其载荷图见图3。

由图3 可知，3 组样品得到明显区分，说明植物乳杆菌的发酵处理显著改变了咖啡渣样品中的化合物组分，这与表1 中的化合物分析结果相符。

图3 不同处理组样品主成分分析结果及其载荷图

咖啡渣植物乳杆菌发酵产物中挥发性成分分析结果见表1。

对3 种不同处理组样品中化合物及其相对含量进行热图分析（见图4），B 组样品相对于A 组和C组，棕榈酸、亚油酸甲酯、2,4-二甲基苯甲醛等化合物含量显著增加，而C 组发酵样品与A、B 组相比，乙酸糠酯、2-乙基-3-甲基吡嗪、3,5-二乙基-2-甲基-吡嗪的含量显著增加且A、B 组未检出，而3-乙基-2,5-甲基吡嗪、咖啡因等作为3 组样品中共有的物质（表1），在C 组发酵样品中的含量得到显著提升。

表1 咖啡渣植物乳杆菌发酵产物中挥发性成分分析结果

3种不同处理方式咖啡渣提取物中化合物热图见图4。

图4 3 种不同处理方式咖啡渣提取物中化合物热图

进一步对化合物结果进行偏最小二乘分析（PLS），根据化合物的VIP 值（Variables' importance of projection）大于1，得到发酵样品中的特征性成分，分别为2 -乙基-3 -甲基吡嗪、3,5 -二乙基-2 -甲基-吡嗪、乙酸糠酯、咖啡因、二糠基醚、3-乙基-2,5 -甲基吡嗪等物质。其中，2 -乙基-3 -甲基吡嗪、3,5 -二乙基-2 -甲基-吡嗪、3 -乙基-2,5-甲基吡嗪等吡嗪类化合物是坚果、豆类等食品中的重要香气成分[10-12]，乙酸糠酯是微生物发酵过程中产生的特征物质[13-14]，而咖啡因作为咖啡产品中的特征物质，二糠基醚作为咖啡豆中的主要挥发性成分[15]，均在植物乳酸菌发酵过程中得到了显著的提升。

挥发性化合物的VIP 得分图见图5。

图5 挥发性化合物的VIP 得分图

3 结论

咖啡渣的生物加工有利于其资源的精深加工及其高值化应用，研究采用植物乳杆菌发酵的方式处理咖啡渣样品，结果表明，通过补充蔗糖作为碳源，有利于促进植物乳杆菌的发酵及其对咖啡渣基质的利用，发酵产物中的酚类物质含量及蛋白含量显著提升，且经植物乳杆菌发酵后，吡嗪类化合物、乙酸糠酯、咖啡因等风味物质的含量显著增加，是咖啡渣发酵产物中的主要特征成分，为进一步开展咖啡渣生物加工技术应用，促进其副产物的综合利用和产品开发提供了一定的研究基础，有利于促进咖啡渣等食品废弃副产物资源的高值化利用。