甘草次酸对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡、侵袭迁移的影响及机制

袁建晖 范燕燕 胡小青

江西省妇幼保健院肿瘤科，江西南昌 330000

子宫内膜癌是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，在妇科中较为常见，占妇科恶性肿瘤的7%左右，是发病率较高的女性生殖系统恶性肿瘤之一[1]。近年来，随着女性生存压力的增加，以及生活、工作等方式的变化，子宫内膜癌的发生率逐年上升，且呈现出一定的年轻化趋势，极大威胁到女性的健康和安全[2]。甘草是我国常见的食药同源性中药，在中医学中已被广泛应用，具有补中益气、清热解毒、去痰止咳等功效，是治疗疾病的良药[3]。甘草的主要成分为甘草次酸，该成分是一种齐墩果烷型五环三萜化合物，已被研究证实有保护心脏再灌注、抑制炎症反应、抗病毒等功效，在肝癌、胃癌、食管癌等恶性肿瘤中，可以抑制肿瘤细胞的增殖，诱导细胞凋亡及抑制肿瘤细胞的侵袭转移，具有良好的抗癌效果[4]。但是从目前临床研究来看，甘草次酸在妇科恶性肿瘤，尤其是生殖系统恶性肿瘤中应用的报道并不多见，因此其作用及机制还有待深入探究，对子宫内膜癌的防治有十分重要的指导意义。为此，本研究就甘草的主要成分甘草次酸对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡、侵袭迁移的影响及机制展开探究，旨在为临床提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

人子宫内膜癌Ishiawa 细胞，由上海生命科学院细胞中心提供。胎牛血清、DMEM 培养基等，购自美国Gibco 公司。MTT 试剂，购自美国Invitrogen 公司。流式细胞仪，购自美国Ambion 公司。细胞凋亡检测试剂盒，购自日本TaKaRa 公司。Transwell 小室，购自美国Corning 公司。

1.2 方法

1.2.1 分组处理 分为实验组及对照组，实验组甘草次酸的浓度设置为：20、40、80、160、320 μmol/L，对照组为加二甲亚枫（dimethyl sulfoxide，DMSO）终浓度不高于2%的培养基。

1.2.2 药物配制及细胞培养 子宫内膜癌Ishikawa 细胞为江西省妇幼保健院实验室保存的细胞株。甘草次酸用DMSO 稀释成50 mmol/L，-20℃分装保存，使用前解冻，并稀释为不同的浓度。使用10%胎牛血清的RIMI1640 培养液，于37℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱内进行培养，取处于对数位生长期且台盼蓝拒染法测定活性在95%以上的细胞进行试验。

1.2.3 MTT 法检测细胞增殖 于96 孔板中接种子宫内膜癌Ishikawa 细胞，于培养箱中进行培养，各组分别加入不同浓度甘草次酸干预24、48、72 h 后去液（20、40、80、160、320 μmol/L），空白孔是不含细胞的RIMI1640 培养液，每孔加入20 μl MTT 溶液，继续培养。4 h 后去液，加入150 μl DMSO，平板离心机10 min。酶标仪上570 nm 波长处检测其OD 值，记录相关数据，实验重复3 次。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 于6 孔板中接种细胞，不同浓度甘草次酸（80、160、320 μmol/L）干预24 h 后用胰酶消化细胞，PBS 洗涤2 次，收集细胞，加入Binding Buffer 500 μl 悬浮细胞。然后加入10 μl Annexin V，4℃避光反应5 min；之后上流式分析仪检测，1、2、3 h 内检测细胞凋亡情况，记录相关数据，实验重复3 次。

1.2.5 Transwell 小室检测细胞侵袭力和迁移的变化用50 mg/L Matrigel 胶1∶8 稀释包被Transwell 小室膜的上室面，4℃过夜，使胶面在上室分布均匀，加入血清液，37℃孵育30 min，培养细胞，调整浓度为2×105/ml，接种细胞，将200 μl 细胞悬液加入上室，下室加入500 μl 含10%小牛血清的培养液，每组设3 个平行孔，培养细胞12～72 h，取出小室，用PBS 洗2～3 遍后酒精固定30 min，将小室风干，0.1%结晶紫染色20 min，计数贴壁细胞，计算细胞的侵袭力。去除Matrigel 胶，重复上述步骤，即可计算细胞的迁移力。

1.2.6 蛋白印迹法检测经过甘草次酸处理过的子宫内膜癌细胞中Caspase-9 的表达情况 提取经过甘草次酸处理过1、2、3 h 的子宫内膜癌细胞Ishiawa 蛋白，用移液枪量取1 ml 索来宝RIPA 缓冲液+10 μl PMSF，反复抽吸并置于冰上静置制得所需蛋白。BCA法测蛋白浓度：配制BCA 工作液，以562 nm 吸光度为标准值，最后计算蛋白浓度。选择配制10% 5ml 的分离胶及2 ml 积层胶。制好的“三明治”夹以“黑对黑、白对白”电转膜条件为：80 mA 恒流电流105 min冰水水浴中进行。封闭、抗体的孵育、eECL 显影及结果统计：一抗的孵育：配制一抗封闭液，4℃冰箱中保存过夜。将过夜孵育的一抗放置于水平摇床上，室温下1 h。二抗的孵育：室温下水平摇床上孵育1 h。按康为世纪发光试剂盒说明书指导配制发光液，放置Bio-Rad 于成像仪上，显示出影像清楚的条带后拍照，统计结果。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间行单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t 检验，行Pearson 相关性分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甘草次酸对Ishiawa 细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

甘草次酸不同浓度组Ishiawa 细胞72 h 增殖抑制率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），甘草次酸浓度升高时，Ishiawa 细胞72 h 增殖抑制率升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。不同浓度两两比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1）。

图1 甘草次酸对Ishiawa 细胞增殖的抑制作用

甘草次酸不同浓度组Ishiawa 细胞凋亡率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），甘草次酸浓度升高时，Ishiawa 细胞凋亡率升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。不同浓度两两比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

甘草次酸不同浓度组Ishiawa 细胞迁移和侵袭数量少于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），甘草次酸浓度升高时，Ishiawa 细胞迁移和侵袭数量减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。不同浓度两两比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 甘草次酸对癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响

2.2 甘草次酸对Ishiawa 细胞中Caspase-9 表达的影响

甘草次酸处理后的Ishiawa 细胞中Caspase-9 表达低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；且甘草次酸处理浓度升高时，Caspase-9 表达量下降，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 甘草次酸对Ishiawa 细胞中Caspase-9 表达的影响

2.3 Caspase-9 表达水平与细胞凋亡、增殖、侵袭率的相关性

Pearson 相关性分析显示，Caspase-9 表达水平与细胞凋亡率呈负相关，与细胞增殖率和侵袭率呈正相关，差异有统计学意义（P＜0.05）（表3）。

表3 Caspase-9 表达水平与细胞凋亡、增殖、侵袭率的相关性

3 讨论

子宫内膜癌是临床最为常见的妇科生殖系统恶性肿瘤之一，具有非常高的发生率，随着恶变程度的加深，会极大地威胁患者的健康乃至安全，早已引起全社会的广泛关注[5-7]。目前，对于子宫内膜癌的研究，多集中在临床治疗方面，但是有关其具体分生物学分子研究并不太多。

在一项关于肉瘤HOS 和HT1080 细胞系的研究中发现，甘草次酸可以通过阻滞G0/G1细胞周期而抑制细胞增殖作用[8]。在肝癌细胞中，甘草次酸通过诱导凋亡发挥作用，通过激活胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信号通路，增加乳酸脱氢酶的释放、增加凋亡蛋白Bax 的表达、促进Caspase-3 蛋白的剪切、激活微管相关蛋白轻链3-Ⅱ（light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）的表达和自噬小体的形成，从而促进肝癌细胞的凋亡[9-12]。甘草次酸可以抑制肿瘤细胞的侵袭转移[13-14]，有研究通过下调侵袭转移相关因子基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）MMP-2、MMP-9 和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的产生，从而抑制乳腺癌细胞的侵袭转移[15]。本研究结果显示，甘草次酸会对子宫内膜癌Ishiawa 细胞的增殖、凋亡、迁移侵袭产生影响，且随着处理浓度的不断增加，产生的作用和效果更加明显。Caspase-9 是被证实的凋亡因子，在许多信号通路上均有表达，通过对凋亡因子表达的分析，可以初步探讨甘草次酸在癌症细胞中的作用机制[16-17]。同时甘草次酸针对在子宫内膜癌细胞中的研究尚未开展，本研究旨在明确甘草的主要成分甘草次酸在子宫内膜癌细胞中的作用，为子宫内膜癌的中药特色治疗提供理论基础。王铭等[18]研究发现，衣霉素可抑制活化的HSC 增殖，促进其凋亡，并上调Caspase-9 蛋白的表达。本研究结果显示，甘草次酸处理后的Ishiawa 细胞中Caspase-9 表达低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；且甘草次酸处理浓度升高时，Caspase-9 表达量下降，差异有统计学意义（P＜0.05），且Caspase-9 表达水平与细胞凋亡率呈负相关，与细胞增殖率和侵袭率呈正相关（P＜0.05），提示甘草次酸可以调控Caspase-9 蛋白的表达，而子宫内膜癌细胞的增殖、凋亡、迁移侵袭作用可能与之有关。

综上所述，甘草次酸对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡、侵袭迁移会产生影响，其机制可能是通过调控Caspase-9 的表达而实现。