链霉菌挥发性化合物提高植物抗病能力的研究进展

郭纹余，郭金英，贺羽茜，彭杰丽，王占武，胡栋*

（1.河北工程大学，河北 邯郸 056000；2.河北省农林科学院农业资源环境研究所，河北 石家庄 050051）

不合理使用化学农药会破坏生态环境，威胁人类健康。植物根际促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）为一种生防剂，具有安全、环保、高效的特点，逐渐成为农业绿色高质量发展关注的热点。链霉菌是PGPR 的一类，广泛分布于土壤、水体等生态系统中，大多具有抗菌活性和能产生天然次级代谢产物的能力。链霉菌不但可以通过溶磷、固氮、产铁和调节植物激素等方式[1，2]促进植物生长，而且其产生的挥发性化合物（volatile organic compounds，VOCs）也具有较高的抗菌活性，对细菌和真菌引起的各种植物病害具有防治作用。对链霉菌VOCs 的分类、VOCs 常用分离鉴定技术、VOCs 对常见植物病原菌的抑制作用以及作用机制研究进展等进行总结，旨为链霉菌VOCs 的深入研究和产品定向开发提供参考。

1 微生物的VOCs

VOCs 是一类小分子、易挥发的化合物，主要包括烯烃、烷烃、醇、酮、萜类、苯类、醛、吡嗪、酸、酯和含硫化合物[3]。VOCs 检测在生物学、环境科学、医学、食品工业等领域应用广泛。微生物产生的VOCs 具有调节植物生长、刺激植物产生激素、诱导植物系统免疫抗性等功能。VOCs 通过与细胞之间的相互作用[4]，参与调节植物生长发育、抑制病原菌侵染的过程。合理利用微生物产生的VOCs，在未来具有很大的应用潜力。不同细菌的代谢途径不完全一样，因此微生物产生的VOCs 也表现出复杂的多样性。多数微生物产生的VOCs 种类和数量与培养基种类、培养条件有关[5]。此外，生长温度以及O2和CO2水平也对菌株的VOCs 产量具有一定影响。Anna-Lena Sunesson等[6]认为，温度升高，O2和CO2浓度越高，会提高大部分VOCs 的产率。人们越来越认识到VOCs 在微生物群落中扮演的不同角色，虽然微生物VOCs 的生物学功能尚不完全清楚，但其作为重要的化学物质，影响着微生物的行为、基因表达和群体行为。

2 常用的微生物VOCs 分离鉴定技术

微生物资源十分丰富，可采取相应的技术分离出有价值的次生代谢产物，并且根据具体情况选出最合适的技术来鉴定分离出的化合物，从而使我们更好地了解和应用微生物，使其利用价值得到最大化。目前，常用的分离鉴定技术主要包括气相色谱-串联质谱法（GC-MS）、顶空固相微萃取（HS-SPME）、搅拌棒吸附萃取（SBSE）等。

2.1 GC-MS

GC-MS 是鉴别VOCs 最基本的技术手段，是一种结合气相色谱强分离能力和质谱高鉴别能力的方法，能从复杂的组分中对未知化合物进行鉴别，目前已广泛应用于挥发性、半挥发性样品的分析。GC-MS 的顶空收集材料一般使用的是一些活性炭等材料，但这些材料对挥发性化合物的吸附存在一定偏好，可能会造成某些化合物不能检测到或者鉴定不出来。

2.2 HS-SPME

HS-SPME 是一种快速无溶剂分离技术，具有萃取物纯度高、易操作、灵敏度高、可与GC-MS 联用等优势，特别适合于低含量挥发性成分的测定，近年来该技术广泛应用于食品，药品等气味分析中。但该技术也存在一些问题亟待解决，如在检测中，萃取头涂层容易影响萃取结果，且对脂肪酸类物质的萃取效果较差。

2.3 SBSE

SBSE 是将一个有聚合物涂层的搅拌棒置于顶空瓶中进行搅拌和萃取的方法，可以消除非挥发性物质的干扰[7]。搅拌棒涂层体积大，萃取效率高，对半挥发性物质灵敏度高，是一种分析异味物质的好方法。但SBSE 的萃取时间通常较SPME 长。

3 链霉菌的VOCs 种类

链霉菌可以产生烷烃、烯烃、酯类、醇类、酮类等120 多种VOCs[8]。目前，已有很多链霉菌的VOCs被发掘出来，如常见的VOCs 有2-甲基异冰片（Mib）[9，10]、反式-1（trans-1）[11，12]、土臭素（geosmin）[6]，它们跟潮湿土壤的霉味或土味有关[13]。2014 年Marzieh Danaei等[14]发现灰链霉菌（Streptomyces griseus）的VOCs中，含量丰富的化合物有苯酚（phenol）、2-甲基-5-甲基乙基（2-methyl-5-1methylethyl）。2020 年Daniel 等[15]对4 株链霉菌的VOCs 进行研究后发现，这4 株链霉菌并不是每株都会产生土臭素和2-甲基异冰片。2020年Xuewei Li 等[16]研究发现，淡紫链霉菌SPS-33（Streptomyces lavendulae） 产生的主要醇类挥发物为3-甲基-1-丁醇（3-methyl-1-butanol）、2-甲基-1-丁醇（2-methyl-1-butanol）和苯乙醇（phenylethyl alcohol）3 种[17]。除淡紫链霉菌外，粪生链霉菌（Streptomyces fimicarius）BWL-H1[18]、绿针假单胞菌致金色假单胞菌亚种（Pseudomo-nas chlororaphissubsp.Aureofaciens）SPS-4[19]等微生物也均可产生这3 种VOCs，并且具有良好的抗菌活性。淡紫链霉菌SPS-33 产生的酯类化合物为癸酸乙酯（ethyl decanoate）、十二酸乙酯（ethyl dodecanoate） 和辛酸乙酯（ethyl octanoate），这些酯类物质具有优异的香气，常作为添加剂应用于食品工业。

4 链霉菌VOCs 对几种常见植物病原菌的抑制作用

病原菌为害着农作物的生长发育，严重时会导致重大经济损失。人们普遍使用化学农药进行病原菌防治，但是长期使用化学农药会造成环境生态失衡，增加植物病害的耐药性和发病率。因此，寻找绿色、高效、环保的防控措施迫在眉睫。微生物VOCs 的最大优点是它们不直接接触农产品，特别适用于表面不能用水溶剂处理的水果和蔬菜。可将VOCs 作为一种微生物熏蒸剂[20]，采用熏蒸的方式防治水果、谷物、坚果等作物采收后感染的病害。研究表明，VOCs 在一定浓度时可抑制其他微生物的生长或新陈代谢活动[21]。链霉菌VOCs 在防治植物病害方面发挥着重要作用，对灰霉菌、尖孢镰刀菌、辣椒炭疽病菌、黄曲霉菌、辣椒疫霉病菌、稻立枯丝核菌等病原菌均具有显著的抑制作用。

4.1 灰霉病

灰霉病菌（Botrytis cinerea） 可为害植物地上部位的所有器官，对果实为害最严重，受害果实表面会出现浅褐色水渍状斑点，进而形成褐色病斑。2010 年LI 等[22]发现，球孢链霉菌（Streptomyces globisporus）JK-1 产生的VOCs 二甲基二硫醚（dimethyl disulfide）、二甲基三硫醚（dimethyl trisulfide） 和苯乙酮（acetophenone）能有效抑制灰霉菌[11，23]。2012 年李其利等[5]发现，链霉菌产生的VOCs 会引起灰霉菌菌丝和孢子内部结构发生变化，经过VOCs 处理后，菌丝出现质壁分离，孢子的细胞壁变厚，液泡明显增多、增大。

4.2 辣椒炭疽病

辣椒炭疽病（Capsicum anthracnose）可引起辣椒落叶、烂果、幼苗死亡，严重时会造成辣椒减产和品质降低。Sawai Boukaew 等[24]研究了甜叶链霉菌（Streptomyces Philanthi） RM-1-138 和沙门链霉菌[25]（Streptomyces salmonis）PSRDC-09 的挥发物对辣椒炭疽病的抑菌效果，结果表明，受到菌株RM-1-138 的挥发物影响后，病原真菌菌丝的扭曲形态表现为独特的泪液状，菌丝上形成孔；菌株PSRDC-09 对辣椒炭疽病菌的抗病最佳孢子浓度为107CFU/mL。在生物防治中，链霉菌RM-1-138 的VOCs 对作物采收后感染的辣椒炭疽病具有很强的防控潜力，且防控效果优于化学杀菌剂。因此，利用微生物中的VOCs 进行农产品采后病害防治是一种可提倡的生防措施。

4.3 尖孢镰刀菌

尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum） 是一类既可侵染植物，又可在土壤内生存的寄生真菌。2015 年Yuncheng Wu 等[26]发现，白链霉菌（Streptomyces albulus）NJZJSA2 产生的VOCs 能完全抑制尖孢镰刀菌的分生孢子萌发，其中挥发性化合物4-甲氧基苯乙烯（4-methox-ystyrene） 对菌核病菌的抑制率达到91.32%。Tamreihao 等[27]也发现链霉菌的VOCs 对尖孢镰刀菌有一定的抑制作用。

4.4 黄曲霉菌

黄曲霉[28]（A spergillus flavus）是食品和农产品储藏中常见的64 种腐败真菌之一，能够产生对人类和其他动物具有高度致癌的黄曲霉毒素，其属于一类致癌物。Boukaew S 等[25]研究表明，链霉菌（Streptomyces philanthi）RL-1-178 产生的VOCs 对黄曲霉菌丝生长有100%的抑制作用，其中L-芳樟醇（Llinalool）、2-巯基乙醇（2-mercapt-oethanol）、土臭味素（geosmin）和二十烷（heneicosane）可能起着重要作用。Lyu Ang 等[29]研究发现，杨林链霉菌（Streptomyces yanglinensis） 产 生 的2 - 甲 基 丁 酸 甲 酯（methyl 2-methylbut-yrate）对黄曲霉抑制效果最佳，还能减少贮藏时黄曲霉对花生仁的污染以及黄曲霉毒素的产生。Mengyu Xing 等[18]研究发现，粪生链霉菌（Streptomyces fimicarius）BWL-H1 产生的VOCs 对黄曲霉的内膜系统和细胞壁造成了严重损伤，并能抑制黄曲霉菌丝生长、产孢，但对孢子囊萌发无明显影响。目前多数研究表明，链霉菌产生的VOCs 对黄曲霉毒素具有良好的抑制作用[39]。

4.5 立枯丝核菌

立枯丝核菌（Rhizoctonia solani） 是一种常见的土传病原菌，宿主植物种类繁多，主要为害幼芽、茎基部和块茎，造成农作物严重减产和品质低下。K Tamreihao 等[30]和Viviane 等[12]发现，链霉菌的VOCs能够抑制病菌立枯丝核菌的菌丝生长。虽然有关链霉菌VOCs 对立枯丝核菌的研究较少，但是已有报道的溶菌杆菌[31]（Lysobacter）、芽孢杆菌[32]（Bacillus）、野油菜黄单胞菌[33]（Xanthomonas campestris）等菌株产生的VOCs 均对立枯丝核菌具有较好的抑制作用。

5 链霉菌VOCs 提高植物抗病性的作用机制

5.1 VOCs 诱导植物系统抗性的作用机制

诱导植物抗病性能的作用机制主要有植物系统获得抗性（system acquired resistance，SAR） 和诱导植物系统抗性（induced system resistance，ISR） 2 种。SAR 主要发生在植物受到病原菌感染后，需要一定的时间积累致病相关蛋白（几丁质酶和葡聚糖酶）和水杨酸[34]。VOCs 主要通过ISR 诱导植物抗病[35，36]。

ISR 具有一种广泛和保守的特性，ISR 对3 个主要群体（病毒、细菌和真菌）都有效，主要受水杨酸（salicylic acid，SA）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）和乙烯（ethy-lene，ET）等植物激素的调控。ISR 需要内源信号分子JA 和ET 的表达，以积累相关防御酶和相关物质（如过氧化物酶、多酚氧化酶、查尔酮合酶、植物抗毒素、酚类化合物等），形成结构和化学屏障抵御病原体[37]。目前ISR 通路的初步研究主要集中在PR 蛋白的作用，ISR 中的信号传输复杂，ISR 通路被认为是PR 蛋白的核心作用，PR 蛋白浓度的增加与植物抗病状态呈正相关[38]。同时激活JA/ET 依赖的ISR 通路和SA 依赖的SAR 通路可提高疾病保护水平。茉莉酸（JA）信号途径[39]，这种途径是植物抵御病原菌侵染和害虫啃食必不可少的一部分，在植物感染病害或昆虫摄食的反应中，亚麻酸从膜脂中释放出来，然后酶作用转化为JA，JA 反过来促使编码蛋白酶抑制剂（PIs）基因的转录激活，以及参与VOCs 或二级化合（如尼古丁和许多酚类化合物）和其他防御相关化合物生产的酶[40]。

ISR 是一种具有长期性和有效性的途径，在病原体感染前，通过VOCs 诱导植物产生抗性，可以降低疾病的严重程度。

5.2 链霉菌VOCs 诱导抗病机制的研究现状

生防剂通过多种机制作用于植物，生防链霉菌通过不同的分子途径在转录水平上刺激植物防御系统，可以用来保护植物免受病原体的侵害，也可以间接诱导ISR。链霉菌VOCs 对病原真菌有不同程度上的抑制作用，多数表现为在受到VOCs 的影响后，病原菌菌丝出现扭曲、蜷缩、细胞壁产生变异，从而抑制病原菌的生长、产孢能力。Rouhallah Sharifi 等[41]表示VOCs 主要通过一种间接机制激活植物ISR 中SA 和JA 信号通路，提高植物的抗病能力，免受病原体侵染，在对真菌病原体的生物防治中发挥重要作用。关于细菌VOCs 诱导植物抗性的机制研究则相对较多，但是关于链霉菌VOCs 诱导植物系统抗性的机制尚不清楚，报道的较少，因此链霉菌VOCs 与植物互作的机理值得进一步研究。Yi H S 等[42]研究表明，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）产生的VOCs 2，3-丁二醇激活了植物根系中的防御，主要通过激活JA 和ET信号通路，能保护细菌细胞免受植物根系分泌物和低pH 值的伤害。而Choi Hye Kyung 等[43]发现解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）释放的VOCs 3-戊醇（3-pentanol）通过激活SA 和JA 信号通路来诱导ISR。目前已知的微生物VOCs 诱导植物抗病机制的案例较少，值得今后进一步研究。

6 问题和展望

大量使用化学农药会造成环境污染，在杀死害虫的同时，也会杀死其它捕食害虫的益鸟、益兽，进而破坏生态平衡。化学药剂对环境造成的污染，经食物链的逐步富集，最后进入人体，引起慢性中毒，对人体造成危害。因此，我们提倡使用绿色、环保、安全的微生物生防措施来帮助植物抵御病害侵染并提高作物产量。微生物VOCs 具有既环保又安全的特性，发展前景广阔。目前已证实链霉菌产生的部分VOCs 对真菌性病原菌有不同程度的抑制作用，可以有效抑制植物病害，并且对采收后的果蔬作物有很好的保护作用。VOCs 能够在不直接接触农作物的情况下保护农作物免受病原菌的侵害，值得我们在原有研究基础上创新VOCs 研究的新路径、新方法、新思维。

链霉菌被广泛应用于医药开发以及农业发展中，但是目前对其产生的VOCs 研究较少，有诸多问题亟待解决。主要包括以下问题：（1）随着微生物次生代谢产物研究的深入，发现新的生物活性次生代谢产物的难度将越来越大[40]；（2）影响细菌产生VOCs的环境因子不清楚，应考虑如何提高微生物产生VOCs的能力和效率；（3）有大量未知的VOCs 有待探索，鉴定VOCs 结构的技术有待提高； （4） 如何解决VOCs 释放的持续性问题； （5）细菌产生的VOCs 作用机制尚不明确，需进一步探索其作用位点和分子机制；（6）链霉菌VOCs 促进植物生长和诱导植物产生抗性等作用机制研究有待深入。

针对上述问题，为了提高微生物次生代谢产物的多样性，为新农药、新医药的筛选提供高质量的化合物，未来应加强以下几方面的研究： （1）结合分子生物学技术开展深入研究，整合多种分离纯化技术，破解含量很低、罕见、难分离的化合物信息； （2）确保农民和相关工作人员在分离VOCs 时的安全性；（3）加强不同学科的交叉融合，如食品、化学、植保等，取长补短，共同探索VOCs 诱导植物抗病的机制。Geun Cheol Song 等[33]在2019 年研制出一种新型温室，将菌株放置在新建立的温室中，使其产生的VOCs 能够缓慢释放，并影响植物。这一技术有利于我们更好地控制VOCs 的释放，但是仍然要注意是否存在其它气体混入的情况。如何更好地利用VOCs，并将其作用到植物中，还需要不断更新和完善技术。相信在信息技术和分子生物学技术等多种技术的结合运用下，更多链霉菌的VOCs 将被陆续发现与应用，从而改善、提高农业的生产水平。