香樟叶浸提物对铜绿微囊藻的抑制研究

王 玲，吴晓青，单 龙

(江苏省盐城环境监测中心，江苏 盐城 224000)

1 引言

樟树系樟树属的常绿乔木植物,是我国亚热带绿阔叶林的主要树种之一，资源丰富。樟树具有驱虫、防腐、耐蛀的特点，可提取樟树叶色素、香料等用来制成植物农药、氧化剂和医药产品等[1～3]。樟树叶为可再生资源,其应用前景广阔，其含有的黄酮类化合物具有抗过敏、降血压、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗病毒、保肝和降血脂等活性[4，5]。在食品学和医学中均已得到广泛应用，在食品工业上可作抗氧化剂、色素和甜味剂等[6],在医学上对治疗冠心病、脑血栓和消除自由基等方面有显著效果[7]。目前，国内外相关研究大多仅针对樟树叶中精油的提纯和利用[8]，而对于其黄酮的提取及含量测定研究甚少。本文采用乙醇提取法提取樟树叶中的黄铜类化合物，并对对每个影响因素进行了分析，采用正交实验确定了最佳提取方案。同时采用硝酸铝比色法测定了香樟叶中黄酮的含量。

微囊藻是一类全球性分布的蓝藻，在我国大部分富营养化的水体中，铜绿微囊藻在数量和发生频率上都占有优势[9，10]。铜绿微囊藻为多细胞的群体,细胞呈浅蓝色、亮绿色或橄榄绿色,大多生长在湖泊池塘等有机质丰富的水体中,营浮游生活。当条件适合时,常会暴发大规模的水华[11]，并且在藻细胞死亡或细胞膜通透性增强时会向水中释放藻毒素导致生态系统失衡，危害人体健康[12，13]。因此，有效控制水体富营养化,防治水华成为环境领域需要深入研究的前沿和热点问题。

化感物质是一类由植物或微生物产生的天然活性物质，具有易降解、高效性等优点，不会在生态系统中积累，生态安全性良好[14～16]。近期，国内外相继开展了利用化感物质抑制铜绿微囊藻的研究，如Xiao等[17]从大麦秸秆中分离出的黄酮木质素(Salcolin)，对铜绿微囊藻具有抑制作用；Li等[18]发现从芦苇中提取的2-甲基乙酰乙酸乙酯(EMA)能够有效抑制铜绿微囊藻的生长；Nakai等[19]从穗状狐尾藻中分离出水溶性多酚和脂肪酸，并证实以上物质对铜绿微囊藻具有强抑制作用；胡利静等[20]使用水杨酸抑制铜绿微囊藻，同样取得了良好的抑藻效果；赵倩名等[21]研究表明槲皮素、儿茶素、山奈酚、异鼠李素和木犀草素在一定程度上阻碍了铜绿微囊藻细胞的生长和对光的捕获与吸收，从而导致其正常生理代谢功能紊乱。因此，本文选用香樟叶提取液以及加入聚丙烯酰胺缓释剂后研究提取液对铜绿微囊藻生长的抑制效应，以期为揭示黄酮化合物抑制藻类生长的机理提供进一步的理论支持。

2 材料和方法

2.1 材料与仪器

香樟叶采自江苏省盐城市盐塘河公园植物园内，所有化学试剂均为AR级。

2.2 铜绿微囊藻的培养

铜绿微囊藻使用BG-11培养液，其配制及用量见表2。

表2 BG-11母液成分及培养液配制用量

将铜绿微囊藻接种于BG-11培养液(用高压蒸汽灭菌锅灭菌)，培养温度25±2 ℃, 光照强度为12000×66%lx，光暗比12∶12，静置培养，每天定时摇动。培养7 d后, 进入对数生长期。当藻生长到对数增长末期后，数其个数，在达到106个/mL后即可用于实验。藻种每7 d转接1次，使细胞始终处于旺盛的对数生长期，以备实验使用。

2.3 实验方法

在接有藻种的培养液中加入一定系列浓度的植物提取液，每天观察藻的生长(测定藻个数、光密度)，由此分析提取液对铜绿微囊藻的生长是否有抑制作用。

2.4 数据处理

提取液对藻类的抑制率公式为:

IR(%) = (1-N/N0)×100%

(1)

式(1)中,IR为抑制率；N为加入提取液组藻密度；N0为对照组藻密度。

3 实验内容

3.1 提取液的制备

采摘新鲜的香樟叶，洗净，放于烘箱中30～40 ℃左右烘干，粉碎成粉。

准确称取10 g左右的香樟叶粉末于烧杯中，加入适量的纯净水，浸泡48 h，超声提取，减压抽滤，定容成100 g(干重)/L，即为水提取液。4 ℃下保存待用。

准确称取10 g左右的香樟叶粉末于烧杯中，加入适量的提取剂丙酮(甲醇)，浸泡48 h，超声提取，减压抽滤，滤液用旋转蒸发器在35℃左右减压蒸馏，以除去提取剂丙酮(甲醇)，剩余提取物用蒸馏水溶解并定容成100 g(干重)/L，即为丙酮(甲醇)提取液。4℃下保存待用。

制得200 g/L的香樟叶水提取液，以2 g聚丙烯酰胺/100 g提取液的比例加入缓释剂，即为缓释水提取液，4 ℃下保存待用。

3.2 化感作用实验

取提取液为母液，稀释为不同的浓度梯度，得到提取液的浓度系列。当藻细胞初始浓度为1×106个/mL左右时，在无菌条件下将提取液、藻种(5 mL)置于250 mL锥形瓶内,加入培养液使培养体系总体积为200 mL。光照培养箱培养条件光暗比：14∶10,温度25±2 ℃。实验期间每日定时摇动各锥形瓶两次，同时随机调换锥形瓶在培养箱中的位置。

3.3 藻生长量的测定

采用藻细胞计数和光密度2个指标表示藻生长量。细胞计数方法是用血球计数板在显微镜(10×40倍)下计数,平行计数2次,取平均值作为此样品计数结果。光密度的测定方法是用722型分光光度计在波长650 nm下,以蒸馏水作为参比,测定藻液的吸光度A650。

4 实验结果与讨论

4.1 香樟叶水提取液对铜绿微囊藻生长的影响

与空白对照相比，加入香樟叶水浸提液后，铜绿微囊藻的生长都受到了一定程度的抑制，浸提液浓度越大，抑制作用效果越明显。在光密度趋势图中，浸提物浓度为1 g/L、2 g/L、4 g/L的藻液光密度都大于对照组，而浓度为9 g/L、12 g/L藻液的光密度明显小于对照组，7 g/L时，光密度与空白对照部分重叠，相差不大。光密度趋势图总体上表现为低促高抑作用(图1～3)。

图1 添加香樟叶水浸出液的铜绿微囊藻生长曲线的影响

图2 添加香樟叶水浸出液的铜绿微囊藻光谱吸收曲线

图3 添加香樟叶水浸出液的铜绿微囊藻抑制率曲线

4.2 香樟叶甲醇提取液对铜绿微囊藻生长的影响

香樟叶甲醇浸提液是对甲醇浸泡抽滤液在35 ℃下减压蒸馏，基本去除甲醇溶剂后，用水溶解(不溶物超声溶解)并定容为100g/L，这样可以扣除溶剂甲醇对铜绿微囊藻生长的影响。另外，由于浸提液本身有颜色，对光密度有一定的影响，所以采取不加藻而提取物浓度相同的空白培养液作为背景，以扣除背景影响(图4、5)。

图4 添加香樟叶甲醇浸出液的铜绿微囊藻生长曲线的影响

图5 添加香樟叶甲醇浸出液铜绿微囊藻光谱吸收曲线

不管是藻密度趋势图还是光密度趋势图，都可以看出，加入甲醇浸提液后，铜绿微囊藻的生长都受到抑制，而且浸提液浓度越大，抑制作用越强(图6)。

图6 添加香樟叶甲醇浸出液铜绿微囊藻抑制率曲线

藻密度趋势图中，1 g/L、2 g/L、4 g/L的浸提液中，藻的生长虽然受到抑制，但是抑制效果并不明显，抑制率在50%上下徘徊，而8 g/L开始，抑制效果显著上升，基本在80%左右(除了第2天，藻计数可能存在一定误差)。而光密度趋势图也可以看出，1 g/L、2 g/L、4 g/L浸提液的吸光度也都处于大于0的状态，8 g/L时，吸光度在0左右，而之后的浓度(12 g/L、16 g/L)吸光度都为负值。

4.3 香樟叶丙酮提取液对铜绿微囊藻生长的影响

丙酮提取液制作与甲醇提去液相似，既要扣除溶剂对铜绿微囊藻生长的影响又要扣除提取物本身颜色对吸光度的影响。

藻密度趋势图中，加入浸提液后，培养前期(2 d)，藻的生长量都很小，后期(3 d后)，低浓度的浸提液中藻开始明显生长，而高浓度浸提液中藻细胞数依然很少。

藻生长稳定后(2 d后)，基本上所有浓度的浸提液中，铜绿微囊藻的抑制率都要超过50%，表现为显著抑制，只有在后期(第7 d)，低浓度的浸提液才表现出抑制率快速下降的问题，这说明它们的作用不持久，而高浓度是相对比较稳定。

光密度趋势图中，基本上所有浓度的浸提物的吸光度都表现为负值(除了0.5 g/L的第6、7 d)，这说明丙酮浸提液抑制效果总体很好(图7～9)。

图7 添加香樟叶丙酮浸出液铜绿微囊藻生长曲线

图8 添加香樟叶丙酮浸出液铜绿微囊藻光谱曲线

图9 添加香樟叶浸出液铜绿微囊藻抑制率曲线

4.4 同一浓度不同溶剂提取液对铜绿微囊藻的生物量的影响

在3 g/L时，甲醇、水、丙酮浸提液都表现了抑制作用，而甲醇浸提液开始表现出抑制作用，所以采用3 g/L时3种溶剂的浸提液作为比较，以此来比较3种溶剂提取效果(图10)。

图10 添加相同浓度不同溶剂香樟叶浸出液铜绿

不同溶剂的提取液制作过程基本上消除了溶剂本身对铜绿微囊藻生长的影响，这样可以直接通过藻的生长情况来判断溶剂的提取效果。图10即为3 g/L浓度时3种溶剂提取液抑制藻生长的抑制率趋势图，从图中可以看出，丙酮的提取液抑制作用最好，水次之，甲醇抑制效果最低。

4.5 香樟叶水提取液加入缓释剂聚丙烯酰胺对铜绿微囊藻生长的影响

在香樟叶水提取液加入聚丙烯酰胺，聚丙烯酰胺可以先将提取物包裹在凝胶组织中，在培养液中适时释放，以达到与培养液中提取物浓度保持平衡，这样既可以保证培养液中提取物的浓度保持在同一浓度，也可以使抑制作用时间持续长久一些。

香樟叶水浸提液中加入缓释剂后，从藻密度趋势图中看出，浓度为4 g/L、8 g/L、甚至是12 g/L时，藻的密度都比空白对照组大，表现为促进作用。但是16 g/L开始，藻密度就急速降低，从抑制率趋势图可以看出，16 g/L开始，抑制率基本保持在50%以上，而且在抑制率趋势图中，可以看出，低浓度是浸提液的抑制率有上升的趋势，开始表现为小的抑制作用。同样，这样的低促高抑的趋势也可以在光密度趋势图中看出(图11～图13)。

图11 添加香樟叶水浸提液缓释后铜绿微囊藻生长曲线

图12 添加香樟叶水浸出液缓释后铜绿微囊藻光谱曲线

图13 添加香樟叶水浸出液缓释后铜绿微囊藻抑制率曲线

出现这种结果，可能一部分是因为提取液的抑制作用不够明显，另外，聚丙烯酰胺缓释剂本身可能对藻的生长有一定的促进作用。实验过程中，加入聚丙烯酰胺的藻培养液有写粘稠，有部分藻黏在锥形瓶的底部，无法进行计数，这对藻密度的结果有很大影响，但是这也从另一个侧面说明，聚丙烯酰胺可以促进藻类的絮凝沉降，那么，在实际应用中，聚丙烯酰胺可以作为絮凝剂，加速造的絮凝沉降，并在水体与底泥的界面上抑制藻类的生长。

4.6 同一浓度下有无缓释剂对铜绿微囊藻生长的影响比较

4 g/L时，香樟叶水浸提液对铜绿微囊藻的生长表现为明显的抑制作用，抑制率基本高于50%，而加入缓释剂后，藻密度明显增大，抑藻效率下降，甚至表现出促进藻类生长。这坑内一部分是因为藻沉积在锥形瓶底部，另外，聚丙烯酰胺对藻的生长可能有一定的促进作用(图14)。

图14 同一浓度下有无缓释剂对铜绿微囊藻生长曲线影响比较

5 结论

(1)香樟叶的水、甲醇、丙酮等溶剂的提取液对铜绿微囊藻的生长都有一定的抑制作用，且提取液浓度越高，抑制效果越好。水提取液还表现出低促高抑的作用，分界浓度为7 g/L。

(2)香樟叶的水、甲醇和丙酮3种溶剂的提取液中，丙酮提取液的抑制效果最明显，水次之，甲醇抑制效果最低。

(3)香樟叶水提取液加入聚丙烯酰胺缓释剂后，对铜绿微囊藻生长也表现出一定的低促高抑作用，但是作用效果比水提取液抑制效果差，可能是因为聚丙烯酰胺本身对铜绿微囊藻的生长有促进作用，另外由于加入了聚丙烯酰胺，培养液有些粘稠，较多藻沉积在锥形瓶底部对藻的计数也有较大影响。