河南省鸡源大肠杆菌的分离鉴定与耐药性分析

吕玉金，艾梦燕，宋予震，周佳淑，王 聪，吴凤笋，李文刚，彭 忠，陈焕春，王湘如

(1.河南牧业经济学院动物医药学院，河南 郑州 450046；2.河南农业大学动物医学院，河南 郑州450002；3.华中农业大学动物医学院，湖北 武汉 430070)

鸡源大肠杆菌病是危害养鸡业的常见细菌性传染病，发病率和死亡率都比较高，经济损失巨大。临床上预防和治疗鸡源大肠杆菌感染主要依赖抗菌药，由于抗菌药不规范使用，导致出现耐药菌株，造成药物残留问题，危害公共卫生安全。有研究表明，大肠杆菌的毒力因子包括黏附素、摄铁系统、侵袭素和血清抗性等[1]。大肠杆菌的毒力与其所携带毒力因子的数量具有显著的相关性[2-4]。一般而言，大肠杆菌携带的毒力基因数量越多，其毒力越强[5]。我国大肠杆菌耐药情况调查表明，畜禽体中所携带的大肠杆菌耐药性十分严峻，张海龙[6]通过对河北省2018—2020年鸡源大肠杆菌进行耐药性检测，结果发现，分离菌株对阿莫西林、强力霉素、复方新诺明、林可霉素等药物的耐药率达70%以上，并呈现逐年增长的趋势；徐亚亚等[7]研究发现，50%的大肠杆菌分离株耐受13种药物，对强力霉素、氨苄青霉素、四环素等抗菌药物的耐药率均已经超过了80%。耐药性菌株的出现，增加了致病性大肠杆菌的治疗难度，因此，本试验通过对河南省鸡源大肠杆菌致病性及耐药性进行检测，以期为其防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源 采集河南省30个规模化养鸡场病死鸡的盲肠、肝脏、心脏等共430份样品。

1.2 主要试剂及仪器 伊红美蓝培养基、LB肉汤，均购自北京陆桥技术有限公司；绿如蓝核酸染料，购自北京天恩泽基因科技有限公司；药敏纸片，购自北京普纳德科技有限公司。恒温培养箱(DHP-9272)，上海百典仪器有限公司；PCR仪(ETC-811)，东胜兴业科学仪器有限公司；电泳仪(DYY-10C)，北京六一仪器厂。

1.3 大肠杆菌的分离纯化与PCR鉴定 在无菌条件下，将采集的430份组织样品进行研磨处理，分别加入3 mL LB肉汤，37 ℃摇床振荡培养16～18 h，采用三区划线法划线接种于伊红美蓝培养基上，挑选黑色、带有金属光泽、边缘整齐、表面光滑、凸起的圆形菌落进行纯化。采用PCR扩增16S rDNA基因的方法进行大肠杆菌的鉴定，扩增引物信息见表1。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 大肠杆菌16S rDNA鉴定引物

1.4 大肠杆菌毒力基因鉴定 采用参考文献[8]中引物序列及多重PCR体系分别扩增17种毒力相关基因，引物信息见表2。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

表2 大肠杆菌17种毒力基因鉴定引物

1.5 大肠杆菌耐药性检测 采样K-B纸片法对分离的大肠杆菌进行药敏试验，受试药物包括头孢哌酮(CFP)、头孢他啶(CAZ)、头孢唑啉(KZ)、头孢噻肟(CTX)、庆大霉素(CN)、阿米卡星(AK)、卡那霉素(K)、链霉素(S)、阿莫西林(AML)、环丙沙星(CIP)、四环素(TE)、诺氟沙星(NOR)、复方新诺明(STX)、氯霉素(C)、克林霉素(DA)、新霉素(N)、大观霉素(SPC)、氨苄西林(AMP)、多西环素(DOX)、氧氟沙星(OFX)和恩诺沙星(ENR)共21种药物，参照美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)标准(第30版)进行抗微生物药物敏感结果判定。

1.6 大肠杆菌耐药基因检测 对大肠杆菌进行耐药基因检测，包括qnrB、floR、sul3、sul2、blaNDM-1、blaKPC、blaOXA-48、blaIMP、mcr-1、blaVIM、tetA、blaCTX-M、blaSHV、blaTEM和cfr共15种耐药基因，采用PCR方法进行鉴定，引物序列、反应体系和反应程序参照参考文献[9]。

2 结果

2.1 大肠杆菌的PCR鉴定 分离纯化后通过PCR方法扩增16S rDNA基因，结果显示，从430份样品中分离鉴定出374株大肠杆菌，分离率为86.98%，见图1。

图1 部分大肠杆菌16S rDNA的PCR鉴定

2.2 大肠杆菌毒力基因鉴定 毒力基因的检测结果显示，17种待检毒力基因中yijp、ompA、fimC、mat基因的检出率高达90.00%以上，ibeB、iss、iroN、iucD基因的检测率在50.00%～80.00%，aatA、tsh、cvaC、fyuA、irp2、chuA基因的检出率在10.00%～50.00%，neuC基因的检出率为0，其他毒力基因检出率低于10.00%(图2)；分析不同菌株所含毒力基因的种类，结果显示，136株大肠杆菌分离株所含毒力基因种数在10种及以上，占比为36.36%；134株大肠杆菌分离株携带8～9种毒力基因，占比为 35.83%；104株大肠杆菌分离株携带7种及以下毒力基因，占比为27.81%(图3)；在携带10种以上毒力基因的136株大肠杆菌分离株中，108株携带了tsh、cvaC、iss、iroN、iucD、irp2毒力基因中的3种及以上(图4)，被界定为致病性大肠杆菌[5]。

图2 大肠杆菌毒力基因分布情况

图3 374株大肠杆菌携带17种毒力基因情况

图4 136株大肠杆菌携带6种毒力基因情况

2.3 大肠杆菌耐药性检测 对108株致病性大肠杆菌进行药物敏感性测试和耐药谱分析。药敏试验结果显示：其中90.00%以上的分离株对氨苄西林、阿莫西林、克林霉素耐药，80.00%～90.00%的分离株对四环素、氯霉素、头孢唑啉、复方新诺明耐药，36.11%的分离株对诺氟沙星表现出耐药性(图5)。耐药谱分析结果显示，其中8株致病性大肠杆菌对20种受试药物表现耐药，占比7.41%；57株致病性大肠杆菌针对15～19种受试药物表现出耐药性，占比52.78%；27株致病性大肠杆菌耐药种数介于10～14种，占比25.00%；16株致病性大肠杆菌耐药种数为9种及以下，占比14.81%，在这16株致病性大肠杆菌中，有13株耐药种数在3种及以上(图6)。

图5 大肠杆菌对不同抗菌药的耐药率

图6 大肠杆菌耐药种数

2.4 大肠杆菌耐药基因检测 检测108株致病性大肠杆菌中15种耐药基因的携带情况。结果显示：sul2(87.04%)、tetA(87.96%)、blaCTX-M(75.93%)这3种耐药基因的检出率较高，均达到了70.00%以上；blaTEM基因检出率为51.85%；未检测出qnrB、blaKPC、blaIMP、blaSHV和cfr这5种耐药基因(表3)。在检测的15种耐药基因中，单菌株检出的耐药基因种数最少为0种，有1株大肠杆菌，占比为0.93%；检出的耐药基因种数最多为7种，有3株大肠杆菌，占比为2.78%；其中携带4种耐药基因的菌株数量最多，有27株大肠杆菌，占比为25.00%；携带5～6种耐药基因的菌株占比介于15.00%～20.00%(图7)。

表3 大肠杆菌耐药基因检出率

图7 大肠杆菌携带耐药基因种数

3 讨论

本试验从河南省部分养鸡场采集430份样品，经细菌分离纯化、PCR鉴定后共获得374株大肠杆菌，分离率为86.98%，结果与我国其他学者的报道一致。如卢晓辉等[10]2009年报道河南省养鸡场大肠杆菌的分离率为78.62%；毛福超等[11]2016年报道豫西地区养鸡场大肠杆菌的分离率为75.38%；艾伟昌等[12]2018年报道河南省某规模化养鸡场大肠杆菌的分离率为83.3%。上述结果均提示，养鸡场中大肠杆的分离率较高，应注意加强针对该病原菌的防控工作。

本试验针对分离到的374株鸡源大肠杆菌进行毒力基因鉴定。在所检测的17种毒力基因中，yijp、ompA、fimC、mat的检出率高达90.00%以上，但neuC的检出率为0；此外，超过36.36%(136/374)的大肠杆菌分离株所携带的毒力基因种类在10种及以上。高丽等[13]从黑龙江省大庆地区分离鉴定出的53株大肠杆菌中，48株含有毒力基因，其中气杆菌素iucD基因占91.0%、强毒力岛fyuA基因占51.3%、外膜蛋白ompA基因占89.0%，而本试验中，iucD基因占76.20%、fyuA基因占23.80%、ompA基因占95.19%。王俊丽等[8]进行的大肠杆菌毒力基因检测中，yijp、fimC、mat、ompA、ibeB、iroN这6种毒力基因的阳性率超过了50%，aatA、tsh、vat、cvaC、iss、iucD、irp2这7种毒力基因阳性率在20%～49%，而本试验中，除yijp、fimC、mat、ompA、ibeB、iroN这6种基因阳性率超过50.00%，iss、iucD基因的阳性率也超过了50.00%，但本试验vat基因的阳性率只有3.21%。王俊丽等[8]进行的试验中携带10种及以上毒力基因的比例为10%，而本试验菌株携带10种及以上毒力基因占比为36.36%。张立伟等[14]分离的鸡源大肠杆菌的fimC和ompA基因的携带率为100%，aatA、yijP、irp2、mat、iss等基因的检出率也达到了90%以上，本试验中yijp、ompA、fimC、mat基因的检出率在90.00%以上，而aatA、irp2、iss这3种基因的检出率与其不一致。综上所述，大肠杆菌在不同地区之间的差异较大。鸡源大肠杆菌携带的毒力基因的数量与其致病性呈正相关，当菌株中携带tsh、cvaC、iss、iroN、iucD、irp2这6种毒力基因中的3种及以上时为致病性大肠杆菌[2,5]。基于此报道，本试验中共有108株分离株可被界定为致病性大肠杆菌。

针对108株致病性大肠杆菌的药敏试验结果显示，90.00%以上的致病性大肠杆菌对氨苄西林、阿莫西林、克林霉素这3种抗菌药耐药，有8株大肠杆菌的耐药种类均达到了20种。2010年，李昆明等[15]对分离出的鸡源大肠杆菌进行24种抗菌药的耐药情况检测，其中链霉素、四环素、氯霉素等10种药物的耐药率达90%，且有21种抗菌药的耐药率大于70%；2016年，毛福超等[11]从豫西地区养鸡场分离得到的大肠杆菌，对20种抗菌药的耐药性的检测结果显示，分离的大肠杆菌对复方新诺明、四环素、氨苄西林这3种抗菌药的耐药率依次递减，20种抗菌药中耐药最多的大肠杆菌有18种耐药，9～14种耐药占77.55%；2018年，艾伟昌等[12]从河南省某规模化养鸡场分离得到的大肠杆菌，对四环素、氨苄西林、复方新诺明等抗菌药耐药严重，耐药率均在80%以上，对20种药物产生耐药的菌株占7.41%，对15～19种药物产生耐药的菌株占52.78%。

本试验对分离出的108株致病性大肠杆菌进行耐药基因的检测，发现sul2、tetA、blaCTX-M这3种耐药基因检出率分别为87.04%、87.96%、75.93%，blaTEM检出率为51.85%，qnrB、blaKPC、blaIMP、blaSHV和cfr这5种耐药基因检出率为0，几乎所有的菌株都含有2种以上的耐药基因，有的菌株含高达7种耐药基因。此次试验中磺胺类耐药基因sul2、四环素类耐药基因tetA、β-内酰胺类耐药基因blaCTX-M与其相对应的耐药表型结果一致，但氯霉素类耐药基因floR与其耐药表型不一致，主要原因在于floR基因主要介导氟苯尼考的耐药机制，而氯霉素的耐药机制由cat基因介导。

本试验从河南省30个规模化鸡场分离出374株大肠杆菌，其中108株大肠杆菌所含毒力基因种类在10种及10种以上，且其携带tsh、cvaC、iss、iroN、iucD、irp2这6种基因中的3种及以上，因此判定为致病性大肠杆菌。108株致病性大肠杆菌对氨苄西林、阿莫西林、克林霉素3种抗菌药的耐药率达90.00%以上。在耐药基因检测中，sul2(87.04%)、tetA(87.96%)、blaCTX-M(75.93%)这3种耐药基因检出率较高，且与其相对应的耐药表型结果一致。由此可见，大肠杆菌的耐药问题较为严重，筛选替抗产品应用于鸡源大肠杆菌病的防治尤为重要，本试验对于了解河南地区鸡源大肠杆菌的流行及耐药性具有一定的参考价值。