LINC02870对肝细胞性肝癌细胞增殖的影响及机制

郭梦雅，邵晓雯，黄佳宁，白楠，李茗鹤，李咏梅

1 天津医科大学基础医学院病原生物学系，天津 300070；2 天津医科大学基础医学院遗传学系

肝细胞性肝癌（HCC）是常见的恶性肿瘤之一，几乎占原发性肝癌的90%［1］。HCC 具有早期症状不明显、进展速度快等特点，导致患者确诊时多为晚期，错过了最佳手术机会［2］。因此，探讨HCC发生发展的机制，明确肝癌转移的分子机制对于发现新的治疗靶点、为HCC 患者制订更有效的诊断和个体化治疗措施至关重要。长链非编码RNA（LncRNA）是一种长度超过200 个核苷酸的非蛋白质编码转录本［3］。众多证据表明，LncRNA 在肿瘤的多种生命过程（肿瘤细胞的增殖、转移、血管生成、耐药、微环境调控和自我更新等）中发挥作用［4-5］。LncRNA 通过多种分子机制对HCC 产生重要影响［6］。2021年5月—2022 年7 月，本研究探讨了长链非编码RNA-02870（LINC02870）对HCC 细胞增殖的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 人HCC 细胞系（PLC 细胞）来自天津医科大学基础医学研究中心转化肿瘤学实验室。LINC02870 质粒及其载体对照pcDNA3.1+质粒购自苏州金唯智生物科技有限公司；DMEM 细胞培养基购自美国GBICO 公司，胎牛血清（FBS）购自上海双洳生物科技有限公司；Lipofectamine2000 转染试剂购自中国宇恒生物科技有限公司；反转录试剂盒、PerfectStart®Green qPCR SuperMix 试剂盒购自全式金生物技术股份有限公司；EdU 细胞增殖检测试剂盒购自中国宇恒生物科技有限公司；真核细胞起始因子4E 结合蛋白1（4EBP-1）、β-肌动蛋白（β-actin）抗体购自上海泊湾生物科技有限公司；磷酸化真核细胞起始因子4E结合蛋白1（p-4EBP-1）购自美国CST公司；HRP标记山羊抗兔IgG抗体购自南京金斯瑞生物科技有限公司。激光扫描共聚焦显微镜购自日本Olympus 公司；Synergy 多功能酶标仪购自美国Biotek 公司，蛋白电泳槽、转膜槽、电泳仪均购自美国Bio-Rad公司。

1.2 细胞培养及转染 将PLC 细胞置于含1%青链霉素、10% FBS 的DMEM 培养基 中，5% CO2、37 ℃细胞培养箱中培养。将PLC 细胞随机分为对照组（转染载体对照pcDNA3.1+质粒）和过表达组（转染LINC02870 质粒）。取5×105个对数生长期细胞接种至6 孔板中，加入DMEM 培养基2 mL，保证转染时细胞密度在70%～90%。次日上午换液，加入Opti-MEM 2 mL，饥饿6 h 后进行转染。取2 μg pcDNA3.1+质粒和2 μg LINC02870 质粒分别加入200 μL Opti-MEM 培养基中，配置质粒稀释液；另准备两组转染试剂各6 μL 分别加入Opti-MEM 培养基200 μL 中，配置转染试剂稀释液；将稀释液用移液器吹打混匀后室温静置5 min；将上述质粒和转染试剂稀释液低速涡旋混匀并瞬离，室温静置20 min；将转染复合物均匀滴加到6孔板中，然后轻轻摇动6孔板，使其混合均匀；37 ℃，5%CO2培养箱培养6 h后弃去Opti-MEM，换DMEM 培养基；转染48 h 后常规进行细胞传代。

1.3 细胞内LINC02870 表达检测 采用实时定量聚合酶链式反应。转染48 h，取两组细胞，用TRIzol法提取细胞总RNA，检测RNA浓度和纯度。取等量RNA 按照反转录试剂盒进行反转录合成cDNA。以cDNA 为模板，应用PerfectStart®Green qPCR Super-Mix 试剂盒进行PCR 扩增。LINC02870 上游引物5'-TGGACGCATGACCAGGATTC-3'、下游引物5'-GAGGCTTGATCTACCACGGG-3'；18s rRNA 上游引物5'-GCTTAATTTGACTCAACACGGGA-3'、下游引物5'-AGCTATCAATCTGTCAATCCTGTC-3'。

反应体系（10 μL）：cDNA 2 μL，引物各0.2 μL、2×PerfectStart®Green qPCR SuperMix 5 μL，RNasefree water 2.6 μL。反应条件：预变性94 ℃30 s；94 ℃5 s，60 ℃30 s，共40个循环。以18s rRNA为内参，用2-ΔΔCt法计算LINC02870相对表达量。

1.4 细胞增殖能力检测 采用CCK8 实验。在细胞对数生长期计数，配置1×104/mL 细胞悬液，以100 μL/孔加入96 孔板，准备4 个重复孔；在种板后24、48、72 h 换10% CCK8 的DMEM 培养基，37 ℃、5% CO2培养箱孵育3 h；在酶标仪上450 nm 波长处检测各孔光密度（OD）值，记录结果。EdU 染色法：在细胞对数生长期计数，取5×105个细胞加入24 孔板，使其在细胞爬片上贴壁生长；次日将组分A 以1∶1 000 加入细胞培养基，37 ℃、5%CO2培养箱孵育2 h；吸弃培养基，PBS清洗细胞2次，每孔加4%多聚甲醛500 μL室温固定30 min；每孔以500 μL含3%BSA的PBS在摇床清洗2次，以500 μL甘氨酸（2 mg/mL）中和5 min；按上述清洗2次，以500 μL 0.5%TritonX-100破膜处理20 min；按照试剂盒说明书配置染色液，按上述清洗2次，每孔以200 μL染色液室温避光孵育30 min；每孔以500 μL 含3% BSA 的PBS 在摇床清洗2次，DAPI复染细胞核15 min，清洗后进行封片、干燥，制备爬片样本，4 ℃避光；利用激光共聚焦显微镜在40 倍物镜下随机拍摄不重复视野，统计每个视野中EdU阳性细胞所占百分比。

1.5 细胞内p-4EBP-1蛋白表达检测 采用Western blotting法。LINC02870过表达及其载体对照细胞用不含血清DMEM 培养基饥饿过夜后收集细胞，PBS缓冲液洗两遍后加入蛋白裂解液，提取各组细胞总蛋白；按照10 μg蛋白量上样，进行SDS-PAGE 分离，将蛋白电泳产物转印至PVDF 膜上；用5%脱脂牛奶室温封 闭1 h 后加入1∶1 000 稀释的4EBP-1、p-4EBP-1 一抗和1∶2 000稀释的β-actin 一抗，4 ℃孵育过夜；次日TBST 清洗3 次，加入1∶3 000 稀释的HRP 标记山羊抗兔IgG 二抗，室温孵育1 h；TBST 清洗3次后，ECL 法曝光条带并拍照；Image J 软件分析灰度值。

1.6 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计量资料用表示，比较采用t检验或重复测量数据的方差分析。计数资料用频数表示，比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LINC02870 转染效率 对照组、过表达组LINC02870 相对表达量分别为1.00 ± 0.07、113.40±1.57，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 过表达LINC02870 对HCC 细胞增殖能力的影响 培养24、48、72 h，过表达组OD 值逐渐升高，且均高于对照组同期（P均＜0.05）；过表达组EdU 染色阳性细胞比例高于对照组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组细胞增殖能力（）

表1 各组细胞增殖能力（）

2.3 过表达LINC02870 对HCC 细胞内p-4EBP-1 蛋白表达的影响 对照组、过表达组p-4EBP-1 蛋白相对表达量分别为1、1.26±0.01。过表达组p-4EBP-1蛋白相对表达量高于对照组（P均＜0.05）。

3 讨论

HCC 是全球最常见的肿瘤之一，每年有超过70万人确诊为HCC，约60万人死于HCC及其相关并发症［7-8］。因此，探索HCC 发生发展的机制，研究HCC复发的预测因子对于进一步提高患者的生存率至关重要。非编码RNA（ncRNA）曾经被认为是没有生物活性的转录噪音［9］。但是近年研究发现，ncRNA在许多细胞过程中发挥着重要作用，ncRNA异常表达可引起细胞增殖、凋亡、转移和侵袭等重要生物过程的紊乱，从而引起恶性细胞转化甚至肿瘤发生［10］。LncRNA是一种广泛参与生物过程的非蛋白质编码转录本。近年来，对LncRNA的研究逐渐增多，通过高通量测序，已确定了大量参与HCC 增殖的LncRNA［11］。因此探究LncRNA 在HCC 中的作用，可为进一步研究HCC相关发病机制和肝癌患者的预后提供科学依据，为开发新的HCC治疗方法提供可能性。

LncRNA 按照其相对于蛋白质编码基因组的位置可分为基因间LncRNA、正义LncRNA、反义LncRNA、内含子LncRNA 和双向LncRNA［12-13］。现已提出了LncRNA 的几种作用机制，如信号、导向、诱饵、支架作用等［14］。LncRNA 在肿瘤进展的所有步骤中都起着重要的调节作用，包括细胞增殖、凋亡、侵袭、转移和血管生成等［15-16］。如LncRNA ANRIL 抑制肿瘤抑制基因CDKN2A/CDKN2B 的功能，从而增强肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移［17］。细胞质LncRNA LINC01554 在HCC 中表达下调，可通过促进Akt/mTOR 信号传导，从而增强HCC 细胞中有氧糖酵解作用［18］，而增强的糖酵解作用已被证实可以促进肿瘤细胞的增殖和迁移［19］。本研究采用CCK8 实验测定450 nm 波长处的吸光度值，反映两组细胞生长相同时间后的细胞数量；用EdU 染色法计数阳性细胞，反映两组细胞生长相同时间后发生DNA 复制的细胞比例。结果显示，在HCC 细胞系中过表达LINC02870，细胞的增殖能力明显提高。

4EBP-1 通过结合真核翻译起始因子4E（EIF4E）阻遏真核翻译起始因子4F（EIF4F）复合体的组装。EIF4F 复合体与mRNA 的5'末端结合可激活mRNA，起始蛋白翻译，其中EIF4E 对于帽依赖性翻译的启动至关重要［20］。4EBP-1 通过mTOR 信号传导维持在高磷酸化状态（非活性形式）［21］。4EBP-1磷酸化导致EIF4E 释放，促进EIF4F 复合体组装，进而参与蛋白翻译起始过程，这对肿瘤细胞的增殖也十分重要［22-23］。如MCF7 乳腺癌细胞系可以被诱导表达4EBP-1的突变形式，该突变体不能通过磷酸化失活。4EBP-1 低磷酸化水平导致细胞周期蛋白D1表达降低，从而造成该细胞的细胞周期停滞，细胞增殖缓慢［24］。转移性肾细胞癌中使用PI3-K/mTOR 抑制剂NVP-BEZ235，可以完全抑制4EBP-1 磷酸化以及细胞周期蛋白D1 表达［25］。本研究中，LINC02870增加了HCC 细胞中4EBP-1 磷酸化水平，从而促进HCC细胞增殖。

综上所述，LINC02870 可能通过促进4EBP-1 磷酸化，参与HCC 细胞中蛋白翻译起始过程，从而促进HCC 细胞增殖。本研究也存在不足之处，LINC02870促进HCC细胞增殖的具体作用机制及其可能相关的信号通路仍需进一步研究。