异氰酸烯丙酯对大鼠垂体腺瘤细胞生物活性的影响及机制

郑淑荣，李丹，高华

北京市神经外科研究所中心实验室，北京100070

生长激素腺瘤是起源于腺垂体的肿瘤性病变，发病初期位于蝶鞍，占垂体肿瘤的10%～15%，主要临床表现与血浆中过多的生长激素（GH）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）密切相关［1］。手术是治疗本病的第一选择，然而跟其他亚型垂体腺瘤比较，生长激素腺瘤全切率低。对于腺瘤切除术后未缓解或者不适宜手术的患者，专家共识建议术后使用生长抑素类、多巴胺受体激动剂和GH 拮抗剂［2-3］。然而，这部分患者难以痊愈，表现为反复复发，血清GH 水平居高不下，是目前临床治疗生长激素腺瘤的难点［4］。芥末油中硫代葡萄糖苷的天然水解产物异硫氰酸酯类化合物（ITC）的摄入量与结直肠癌、前列腺癌和肺癌发病风险呈负相关，具有诱导细胞周期阻滞的作用［5］。在ITC家族众多成员中，以异硫氰酸烯丙酯的含量较高。2021 年1 月—2022 年4 月，本研究观察异硫氰酸烯丙酯对大鼠垂体腺瘤细胞生物活性的影响，并探讨其机制，为天然小分子药物治疗垂体腺瘤提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料 大鼠垂体腺瘤细胞（GH3 细胞）、F12 培养基购自美国ATCC 公司。异硫氰酸烯丙酯、DMSO购自美国Sigma 公司，［3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲酯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑（金翁-内盐，MTS）购自美国Promega 公司；凋亡和细胞周期检测试剂盒购自美国BD公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；细胞周期蛋白激酶-4（CDK-4）、p21和p27抗体购自英国Abcam公司；RIPA裂解液和各种二抗购自北京普利莱基因技术有限公司。多功能酶标仪、量化成像流式细胞仪和超灵敏多功能成像仪购自美国GE公司。

1.2 GH3 细胞培养及分组 大鼠GH3 细胞培养于F12-K 培养基中（2.5%胎牛血清、10%马血清），置于37 ℃和5%CO2培养箱中常规培养，每2天更换培养基，当细胞贴壁生长到90%时用0.25%胰酶消化细胞1∶2传代。将细胞随机分为0.1、1、10 μmol/L实验组及对照组，分别给予终浓度0.1、1、10 μmol/L异硫氰酸烯丙酯及等体积DMSO继续培养。

1.3 GH3 细胞增殖能力检测 采用细胞增殖试验。取对数生长期细胞，调整至105/mL，96 孔板中每孔加入100 μL 细胞悬液，随机分组并加入不同浓度的异硫氰酸烯丙酯和等体积的DMSO，细胞贴壁后，分别培养24、48、72 h，每孔加入20 μL 的［3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲酯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑继续孵育3 h，用酶标仪检测490 nm 波长处吸光度值（OD值）。

1.4 GH3 细胞周期检测 采用流式细胞术。取对数生长期的细胞，接种于6 孔板（3×105个/孔），细胞贴壁后，随机分组并加入不同浓度的异硫氰酸烯丙酯和等体积的DMSO，培养24 h 后胰酶消化细胞，用4 ℃预冷的PBS 缓冲液洗3 遍，加入预冷70%乙醇，4 ℃过夜，1 000 r/min，离心5 min，离心半径13.5 cm，收集细胞，冷PBS 洗1 遍，加入500 μL 含5 μL PI 和5 μL RNaseA，4 ℃避光30 min，上机检测各周期细胞百分比。

1.5 GH3细胞培养上清液中GH、IGF-1水平检测 采用ELISA法。取对数生长期的细胞，调整至105/mL，96 孔板中每孔加入100 μL 细胞悬液，细胞贴壁后，随机分组并加入不同浓度的异硫氰酸烯丙酯和等体积的DMSO，培养24 h后，每孔取20 μL培养上清液，按照ELISA试剂盒说明书进行检测。

1.6 GH3 细胞内细胞周期相关蛋白（CDK4、p21、p27）检测 采用Western blotting 法。取对数生长期的GH3 细胞，种入6 孔板（1×106个/孔），细胞贴壁后，随机分组并加入不同浓度的异硫氰酸烯丙酯和等体积的DMSO，培养24 h 后胰酶消化细胞，冷PBS洗2 遍，1 000 r/min，离心5 min，离心半径13.5 cm。每组加入RIPA裂解液100 μL，冰上孵育2 h，提取蛋白、电泳、转膜［6］。CDK4（1∶2 000）、p21 蛋白（1∶1 000），p27 蛋白（1∶500）、GAPDH（1∶8 000）一抗孵育过夜；TBST 洗膜3 次，10 分/次；二抗（1∶8 000）室温封闭30 min，TBST 洗膜3 次，加入ECL 发光剂，Amersham Image 600 扫描条带并计算灰度值。目的蛋白灰度值与GAPDH 灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.7 统计学方法 采用SPSS19.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；不同时间点比较采用重复测量方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞增殖能力比较 培养24、48、72 h，对照组及0.1、1、10 μmol/L 实验组增殖能力（OD 值）逐渐降低（P均＜0.05）。见表1。

表1 各组细胞增殖能力（OD值）比较（）

表1 各组细胞增殖能力（OD值）比较（）

注：与对照组同期比较，*P＜0.05；与0.1 μmol/L实验组同期比较，#P＜0.05；与1 μmol/L实验组同期比较，※P＜0.05。

2.2 各组细胞周期分布比较 对照组及0.1、1、10 μmol/L 实验组G1期细胞比例逐渐升高，S 期细胞比例逐渐降低（P均＜0.05）。见表2。

表2 各组细胞周期分布比较（%，）

表2 各组细胞周期分布比较（%，）

注：与对照组同期比较，*P＜0.05；与0.1 μmol/L 实验组同期比较，#P＜0.05；与1 μmol/L实验组同期比较，※P＜0.05。

2.3 各组细胞培养上清液中GH、IGF-1 水平比较 对照组及0.1、1、10 μmol/L 实验组细胞培养上清液中GH、IGF-1 水平逐渐降低（P均＜0.05）。见表3。

表3 各组细胞培养上清液中GH和IGF-1水平比较（ng/mL，）

表3 各组细胞培养上清液中GH和IGF-1水平比较（ng/mL，）

注：与对照组同期比较，*P＜0.05；与0.1 μmol/L 实验组同期比较，#P＜0.05；与1 μmol/L实验组同期比较，※P＜0.05。

2.4 各组细胞内CDK4、p21、p27蛋白表达比较 对照组及0.1、1、10 μmol/L 实验组CDK4 蛋白相对表达量逐渐降低，p21、p27 蛋白相对表达量逐渐升高（P均＜0.05）。见表4。

表4 各组细胞内CDK4、p21和p27蛋白表达比较（）

表4 各组细胞内CDK4、p21和p27蛋白表达比较（）

注：与对照组同期比较，*P＜0.05；与0.1 μmol/L 实验组同期比较，#P＜0.05；与1 μmol/L实验组同期比较，※P＜0.05。

3 讨论

生长激素腺瘤是常见的功能性腺瘤，血浆GH、IGF-1 的长期升高增加了消化系统、呼吸系统和循环系统的发病率，死亡风险增加了2 倍。手术、药物和放疗是目前的主要治疗方法，然而手术有效率不到一半［7］。本课题组前期发现，在生长激素腺瘤中，雌激素受体a 高表达，应用雌激素受体拮抗剂氟维司群科抑制GH3 细胞增殖［8］。本研究发现，异硫氰酸烯丙酯调控GH3 细胞周期相关蛋白的表达，引起G1期阻滞，起到抑制GH3 细胞生物活性的作用。

在临床上，抗雌激素疗法是批准用于肢端肥大症和激素依赖性肿瘤实体（如乳腺癌）的治疗方案。如抗雌激素疗法可用于雌激素受体阳性乳腺癌的治疗，雌激素受体阳性占所有乳腺癌的50%～80%，肿瘤抑制率在50%～60%，而受体阴性患者的肿瘤抑制率仅为7%。体外试验证实，抗雌激素药物如巴泽多昔芬、氯米芬、雷洛昔芬和氟维司群通过诱导细胞凋亡降低垂体腺瘤细胞的存活率［9］。

异硫氰酸烯丙酯是白芥子油中的主要成分，具有促进衰老、诱导凋亡和肿瘤抑制功能［10-12］。作为天然存在的植物化合物，异硫氰酸烯丙酯可以通过以下机制起作用，通过在天然激素的结合位点充当配体来模仿天然激素的作用；通过阻断雌激素和雌激素受体的生理结合位点的相互作用来拮抗这些激素的作用；与有关激素直接或间接反应；改变激素合成、降解的自然模式；改变细胞激素受体水平。本研究发现，异硫氰酸烯丙酯抑制GH3细胞增殖，存在G1期细胞阻滞，细胞培养上清中GH、IGF-1 水平明显降低。

细胞周期失调是肿瘤发生的主要原因，CDK 的过度激活促进DNA 复制。p21 和p27 是细胞周期抑制因子Cip/Kip 家族的主要成员，在生长激素腺瘤中其表达水平与肿瘤侵袭、体积及复发呈负相关。生长抑素类药物能够抑制细胞周期蛋白E 的表达，并上调肿瘤组织中p27 的表达。在哺乳动物细胞周期G1期，D 型细胞周期蛋白结合并激活相关的CDK4/6，从而发挥催化活性和原癌基因的作用。本研究发现异，硫氰酸烯丙酯能够抑制CDK4 蛋白表达，上调p21、p27蛋白表达，从而引起GH3细胞在G1期阻滞，降低S期细胞比例。

综上所述，天然小分子硫氰酸烯丙酯能够抑制GH3 细胞活性，将细胞阻滞在G1期，其可能机制是调控CDK4、p21、p27蛋白表达。