外周血单个核细胞与纯化CD34+细胞移植在治疗血栓闭塞性脉管炎导致重度肢体缺血的长期疗效比较

刘 浩 方 圆 潘天岳 方 刚 刘轶凡 蒋小浪 陈 斌 顾史洋 魏 征 刘 澎 董智慧 符伟国

重度肢体缺血(critical limb ischemia，CLI)是下肢动脉疾病的终末阶段，主要表现为静息痛、缺血性溃疡及坏疽。国外研究[1]结果显示，CLI患者的截肢率为10%～40%，截肢后的患者5年死亡率仍高达70%，给国家、社会及家庭带来沉重的负担。目前，主流的CLI治疗方法包括开放手术及腔内治疗，前者包括下肢动脉旁路移植术、下肢动脉内膜剥脱术等，后者包括支架植入、球囊扩张、下肢动脉腔内减容术等。然而，接受上述常规治疗后，仍有15%～20%的CLI患者术后血管再闭塞发生率和截肢率均较高，被称为难治性重度肢体缺血(no-option critical limb ischemia，NO-CLI)患者[2-6]。相较于其他CLI患者，NO-CLI患者预后不尽如人意，术后1年死亡率为20%～40%、截肢率高达30%～50%[7-10]。血管炎性重度肢体缺血(angiitis-induced critical limb ischemia，AICLI)是指由血管闭塞性脉管炎(thromboangiitis obliterans，TAO)及其他免疫系统疾病导致的CLI，其特点为肢体远端中小动脉受累，导致血管缺乏“流出道”，且由于疾病本身原因，术后极易发生血管再闭塞，故AICLI是NO-CLI的重要组成部分。TAO亦称伯格病(Buerger’s disease)，由Buerger医师于1908年首次报道[11]。TAO的发病率并不高，但AICLI患者中TAO占比极高[11-13]。

细胞移植疗法由Asahara等[14]于1997年率先提出，其在治疗TAO等NO-CLI疾病方面的安全性和有效性已经研究[13-14]证实。目前，治疗TAO的细胞产物包括骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cell，BMMNC)、外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMNC)及纯化CD34+细胞(purified CD34+cell，PCC)。BMMNC需于全身麻醉下行腰椎穿刺获取，具有创伤性，故BMMNC移植在临床应用受限。目前临床常采用PBMNC或PCC移植治疗TAO，但两者的长期安全性和有效性是否存在差异尚不明确。本研究通过回顾性分析并比较47例接受PBMNC或PCC移植的TAO患者的长期随访结果，旨在总结这两类细胞产物的特点及其优势。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择自2014年8月—2016年12月于复旦大学附属中山医院血管外科确诊为TAO并接受细胞移植治疗的患者43例，均为男性；年龄范围20～58岁，年龄为(41.7±10.6)岁。根据移植的细胞产物将患者分为PBMNC组(23例)和PCC组(20例)。所有患者的诊断均符合Shionoya诊断标准[15]。纳入及排除标准参考文献[13]。纳入标准：①18～80岁的男性或女性；②经CTA、MRA和(或)DSA检查示下肢动脉狭窄程度>70%或完全闭塞，患者的临床缺血症状(静息痛、溃疡)与检查结果相符；③处于下肢CLI状态(静息痛为卢瑟福4级、溃疡为卢瑟福5级[16]，<4级为非CLI状态)；④下肢静息痛和(或)溃疡经保守治疗(包括抗凝、抗血小板聚集、扩血管、运动治疗和严格戒烟)≥1个月后无缓解或好转；⑤经外科开放手术或腔内治疗后3个月，症状仍无好转。排除标准：①移植前3个月内发生严重不良事件，包括心肌梗死、脑卒中、严重肝功能不全和肾功能不全、肺栓塞等；②预期寿命<1年；③增殖性视网膜病变；④存在注射粒细胞集落刺激因子(C-GSF)禁忌。本研究经医院伦理委员会审核并批准(伦理号为Y2019-099)，所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法 细胞移植的方法参考文献[2]。所有患者均予皮下注射人重组粒细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony-stimulating factor，rhG-CSF;上午9时300 μg，下午3时150 μg，每日共450 μg)及低分子肝素(4 100 U)，连续注射5 d,每日监测血常规指标。于第5天晨皮下注射rhG-CSF 300 μg，静脉注射葡萄糖酸钙1 g及地塞米松5 mg后，行颈静脉及股静脉穿刺置管。将两根静脉置管分别连接至COM.TEC血细胞分离机(德国费森尤斯公司)进行血浆分离置换获得PBMNC，再将PBMNC于免疫磁珠分选仪器(德国美天旎公司)上进行细胞纯化获得PCC。采用锥虫蓝染色测定准备移植的PBMNC、PCC的细胞活力，并行流式细胞术检测直接计算出PBMNC、PCC的CD34+细胞浓度。准备完毕后，于全身麻醉下将PBMNC或PCC在缺血侧下肢(注射范围为小腿及足部)行均匀肌内注射，每点注射PBMNC或PCC 0.5 mL；干细胞移植流程见图1。所有患者移植后均长期口服拜阿司匹林(0.1 g，每日1次)及西洛他唑(0.1 g，每日2次)。

1.3 数据收集 收集所有患者术前的基线资料：年龄、BMI、合并症(高血压病、糖尿病、高脂血症)、吸烟史、既往史(冠心病、脑血管疾病、肺栓塞)，肢体缺血部位、CLI的卢瑟福分级，药物治疗情况(抗血小板药物、西洛他唑、前列腺素类药物、抗凝药物)、手术类型[旁路移植术、内膜剥脱术、支架植入术、球囊扩张术、交感神经切除术、溶栓术、大截肢(踝上截肢)]。记录并比较两组移植细胞产物的体积和移植CD34+细胞数量。

A 患者行血浆分离置换 B PBMNC上机进行纯化C 左为PBMNC，右为纯化PCC D 对患者患侧小腿及足部进行均匀肌内注射图1 患者接受干细胞移植的流程

1.4 观察指标 观察指标包括安全性指标和有效性指标。安全性指标：围手术期全因死亡、开始注射rhG-CSF至移植后2周内发生的不良事件(心肌梗死、脑梗死、肝肾功能异常、白细胞计数持续增高、注射点疼痛)，以及随访期间有无病理性视网膜增生发生。

有效性指标：无大截肢生存率(major amputation-free survival，MAFS)、无痛步行时间(pain-free walking time，PFWT)、Wong-Baker面部疼痛评分(Wong-Baker faces pain rating scale，WBFPS)、踝肱指数(ankle-brachial index，ABI)、趾肱指数(toe-brachial index，TBI)、经皮氧分压(transcutaneous oxygen pressure，TcPO2)、卢瑟福分级及复发。PFWT是患肢的功能学指标，WBFPS用于评价患者静息痛程度，ABI、TBI和TcPO2用于评估患肢血供情况。复发定义为移植侧肢体缺血缓解后再次转为CLI状态。所有患者于移植后第1、2、3、6、9、12个月进行随访，此后每年随访1次，记录移植前和移植后1、3、5年的PFWT、ABI、TBI、TcPO2，以及非CLI状态的患者比例。

2 结 果

2.1 两组基线资料比较 两组患者的年龄、BMI，以及合并症、吸烟史、既往史、肢体缺血部位、CLI的卢瑟福分级、药物治疗情况和手术类型的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。见表1。

表1 两组患者基线资料比较

2.2 两组细胞产物比较 PBMNC组移植的细胞体积为(80.2±12.4) mL，显著大于PCC组的(40.1±2.6) mL (P<0.001)。PCC组的CD34+细胞比例为(69.42±12.02)%，显著高于PBMNC组的(0.31±0.12)%(P<0.001)。所有患者移植CD34+细胞数量均>1×105个/kg。PBMNC组、PCC组患者移植CD34+细胞数量分别为(4.2±1.6)×105、(3.6±1.2)×105个/kg，两组间的差异无统计学意义(P=0.177)。

2.3 安全性指标比较 两组围手术期均无全因死亡患者，开始注射rhG-CSF至移植后2周内亦未发生心肌梗死、脑梗死、肝肾功能异常、白细胞计数持续增高。12例患者术后有注射点疼痛，其中PBMNC组注射点疼痛发生率为43.5%(10/23)，显著高于PCC组的2/20(P=0.015)。 随访期间两组患者均未发生增殖性视网膜病变。

2.4 有效性指标比较 PCC组1例患者于移植后1个月失访，1例患者于移植后51个月因肺部感染死亡。余患者随访时间均≥5年。所有患者术后随访时间范围1～87个月，随访时间为(69.0±17.2)个月。PBMNC组1例患者于术后2个月行大截肢，1例患者于术后41个月行大截肢。PBMNC组移植后第5年的MAFS为91.3%，PCC组为94.7%，两组间的差异无统计学意义(P=0.651)。

两组间移植前和移植后1、3、5年的PFMT、WBFPS、ABI、TBI、TcPO2的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。与同组移植前比较，两组移植后1、3、5年的PFMT均显著延长(P值均<0.001)，WBFPS均显著降低(P值均<0.001)，ABI、TBI、TcPO2均显著增高(P值均<0.001)。见表2。

移植前所有患者卢瑟福分级均为5级。PBMNC组移植后1、6个月和1、3、5年非CLI状态的患者比例[21.7%(5/23)、69.6%(16/23)、82.6%(19/23)、87.0%(20/23)、82.6%(19/23)]均显著高于同组移植前(0，P值均<0.05)，PCC组移植后6个月和1、3、5年非CLI状态的患者比例(0、7/19、14/19、16/19、15/18)均显著高于同组移植前(0，P值均<0.05)。PBMNC组移植后1、6个月非CLI状态的患者比例均显著高于PCC组同时间点(P值均<0.05)，两组间移植后1、3、5年非CLI状态患者比例的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。

表2 两组移植前后有效性指标比较

随访过程中，共有4例患者移植后复发，其中PBMNC组3例，PCC组1例。PBMNC组中1例患者于移植后40个月复发缺血性溃疡，后因缺血进展过快合并感染行大截肢；1例患者术后43个月复发缺血性溃疡，经保守治疗(药物及运动治疗)后症状缓解；1例患者术后4年复发静息痛，经保守治疗缓解。PCC组1例患者术后50个月复发缺血性溃疡，于术后51个月因肺部感染死亡。

3 讨 论

早在19世纪TAO就已被报道，但直至目前对其发生、发展的机制仍知之甚少，TAO可导致严重后果，一些中青年男性患者因TAO而截肢，丧失了劳动力，给家庭、社会和国家造成沉重的负担。在细胞疗法出现之前，开放手术及腔内治疗作为治疗TAO的主流方法，并未取得令人满意的效果。旁路移植术后的1年通畅率仅为41%，Ⅱ期通畅率为54%，踝上截肢率高达31%，且有34.8%的患者在42岁前丧失劳动力[17-18]。腔内治疗术后1年的无截肢或无再干预率仅为70.9%[19]。细胞疗法治疗TAO的安全性和有效性现已被相关研究[13-14]证实。

复旦大学附属中山医院血管外科自2009年起开展自体细胞移植治疗NO-CLI的临床研究，迄今已治疗190余例患者，其中TAO患者比例高达90%以上[13]。为了对比移植PBMNC与PCC治疗TAO的长期疗效，本研究回顾性纳入了自2014年8月—2016年12月于复旦大学附属中山医院血管外科接受PBMNC或PCC移植的43例患者，纳入患者符合TAO的临床特征，即以年轻男性为主、吸烟、存在低心血管风险因素。本研究结果显示，PBMNC组、PCC组移植后第5年的MAFS分别为91.3%、94.7%，两组间差异无统计学意义；表明两类细胞产物治疗均能使TAO患者获得满意的保肢效果。两组间移植前和移植后1、3、5年的PFMT、WBFPS、ABI、TBI、TcPO2的差异均无统计学意义；与同组移植前比较，两组移植后1、3、5年的PFMT均显著延长，WBFPS均显著降低，ABI、TBI、TcPO2均显著增高；提示PBMNC和PCC移植后患肢血供和功能均改善明显。PBMNC组移植后1、6个月和1、3、5年非CLI状态的患者比例均显著高于同组移植前，PCC组移植后6个月和1、3、5年非CLI状态的患者比例均显著高于同组移植前；表明PBMNC组移植后1个月卢瑟福分级即有改善，而PCC组直至移植后6个月卢瑟福分级才有改善；推测卢瑟福分级改善时间不同与两种细胞的构成有关。虽然CD34+细胞被认为是细胞疗法中促进血管新生的主要效应细胞，但CD34-细胞也可分泌大量促血管新生因子[20]。因此，PBMNC移植不仅可通过CD34+细胞的迁移、分化、旁分泌等作用促进血管新生，还有着CD34-细胞的旁分泌作用。

本研究结果显示，PBMNC组注射点疼痛发生率显著高于PCC组；两组均无围手术期全因死亡患者，开始注射rhG-CSF至移植后2周内亦未发生心肌梗死、脑梗死、肝肾功能异常、白细胞计数持续增高，随访期间两组患者均无病理性视网膜增生发生。上述结果提示，PBMNC和PCC移植均具有安全性。推测PBMNC组注射点疼痛发生率显著高于PCC组的原因有两点：①PBMNC组移植的细胞体积显著大于PCC组，导致移植后小腿及足部组织肿胀更为明显；②PCC组中CD34-细胞比例较低，虽然CD34-细胞可产生促血管新生的旁分泌作用，但其移植后可发生炎症反应，对组织产生刺激作用。

通过本研究的结果，总结两类细胞产物移植治疗TAO的特点为PBMNC能较快地缓解缺血症状，PCC移植后注射点疼痛发生少。因此，对于缺血进展快、缺血程度严重的患者，推荐移植PBMNC，从而尽早缓解缺血症状，提高保肢率；对于静息痛严重的患者，推荐移植PCC，移植后注射点疼痛发生少，有助于减轻患者静息痛。

综上所述，TAO患者经PBMNC或PCC移植治疗后均获得令人满意的长期疗效。PBMNC移植后早期即可改善卢瑟福分级，而PCC移植后注射点疼痛发生较少。然而，本研究病例数量较少，有待更大规模的前瞻性临床试验来验证这一结论。