贝类中甲肝病毒检测技术研究进展

朱金艳，高 彬，孙淼淼，陈 思，杨 宇，麻丽丹

（1.庄河市检验检测认证技术服务中心，辽宁庄河 116400；2.沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳 110866；3.庄河市农业发展服务中心，辽宁庄河 116400；4.大连海关技术中心，辽宁大连 116000；5.丹东海关，辽宁丹东 118000）

甲型肝炎病毒（Hepatitis A Virus，HAV）是平均孔径大小约为27 nm、无病毒包膜、单链小核糖核酸病毒。全球每年感染HAV的人数约有1 000万人，其中大约50%的感染源无法确定，仅有2%～3%的报告病例属于食源性感染病例[1-2]。传播途径通常分为水型暴发、食物型暴发、散发式感染等[3]。目前很多研究人员都使用国际标准方法ISO 15216—2017或采用蛋白酶K法的提取方式对其进行检测，而上述方式都存在回收率较低、操作烦琐、耗时较长等问题[4]。为提升贝类检测的规范性和准确性，本文对贝类样品中HAV的提取和检测方法的现状展开论述，为贝类中HAV的检测提供参考。

1 贝类中甲肝病毒污染

1.1 贝类中食源性甲肝病毒污染情况

许多国家的研究和数据证实了贝类是HAV的重要传播载体。由于贝类通过消化系统过滤海水来获取食物，能将海水中的病毒在体内积累，从而易于引发病毒型食源性疾病。2016年全世界有7 134人死于甲型肝炎，因此贝类的病毒污染给消费者带来严重的健康风险，并且有可能给海鲜行业造成重大经济损失[5]。

1.2 贝类中食源性甲肝病毒检测存在的困难

病毒的传染剂量很低，少量病毒颗粒就可以造成大量传染，并且病毒颗粒在离体条件下，以无生命的生物大分子状态存在，并保持其侵染性。此外，这种病毒的序列变异较大，血清型也较多。贝类食源性甲肝病毒检测中所存在的问题主要有以下几点。①贝类食物中的HAV浓度较低。②HAV培养周期较长，很难实现快速测定。③从病毒中提纯RNA的有效性较低。④贝类的生长环境复杂，导致其存在多种干扰杂质。

2 贝类中食源性甲肝病毒的提取方法

RNA的提取是病毒检验的关键步骤。病毒的提取是从食物基质中分离出病毒，去除抑制性化合物，并浓缩一定体积。甲肝病毒RNA的提取方法主要有3种，分别为酸吸附—洗脱—浓缩法、直接提取RNA法和蛋白酶K处理法。

2.1 酸吸附-洗脱-浓缩法

酸吸附—洗脱—浓缩技术用于从碳水化合物 、脂肪、蛋白质食品以及贝类产品中提取食源性病毒。通常洗脱步骤需使用中性或碱性洗脱缓冲液。PAPAFRAGKOU等通过酸吸附—洗脱—浓缩方法从5 g牡蛎中检出HAV为2×100～102RT-PCRU[6]。

2.2 直接提取病毒RNA法

直接提取病毒RNA法是采取物理或化学的方法，直接破坏病毒分子，提取病毒RNA。直接提取病毒RNA法已成功应用于脂肪、蛋白质类食品，研究数据显示，利用锆珠粉碎牡蛎消化组织，再通过直接提取病毒RNA法从0.15 g的牡蛎消化组织中成功提取到10 RT-PCRU[7]。

2.3 蛋白酶K处理法

利用蛋白酶K的消化功能，可以将贝类样本消化组织中的病毒分子更好地释放出来，提高病毒RNA的提取效率。一般情况下，经蛋白酶处理的样品可以经过PEG沉淀浓缩或高速离心浓缩进一步提高检测的灵敏性。近年来，市场上可供使用的商业病毒RNA提取检测试剂盒日渐增多，极大地改善了RNA的提纯操作步骤，有效提升了RNA扩增检测的灵敏度和获取效果[7]。

3 贝类中甲肝病毒的检测方法

贝类中甲肝病毒的检测方法目前主要有分子生物学法、斑点金免疫结合法、近红外免疫层析法、电化学免疫法和电镜观察法。

3.1 分子生物学

3.1.1 PCR法

PCR法即聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），是以DNA为模板，特定引物为起点，在DNA聚合酶的作用下进行延伸，利用核苷酸底物通过变性、退火、延伸等步骤，将DNA增加到所需数量进行分析的过程。通常PCR法无法对贝类中甲肝病毒指定基因组定量，且敏感度较低，导致该法在检测中的使用受到限制。

3.1.2 RT-PCR法

RT-PCR即逆转录PCR法（Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction），是将RNA的反转录RT和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。RT-PCR法由于效率较高、价格低廉，在实验室中使用较为广泛[6]。但存在的问题是每次反应仅扩增一次模板，在实际使用中很难做到同时处理大批量的样品。乔煜婷等用免疫磁珠法提取病毒后，采用RTPCR检测法顺利地测定到了水域土壤中残留的甲型肝炎病毒，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优势[8]。

3.1.3 RT-qPCR

RT-qPCR法即实时荧光PCR定量法（Real-Time-Quantiative PCR），荧光物质被添加到PCR反应体系中，并在每个PCR周期后实时监测荧光体信号的积累，以便对起始模板进行定性和定量分析。目前此法应用于食品行业检测、分子生物学研究、临床疾病诊断等方面。

3.1.4 基因芯片检测法

基因芯片检测法是一种微芯片技术，通过机器或原位合成将高密度的DNA片段按特定顺序附着在固相表面，用同位素或荧光材料对DNA探针进行标记，以实现基于碱基互补杂交原理的详细基因表达和监测研究。该方法具有检测信息量大、可行性强和系统集成化等多种优势。目前基因芯片法研究需要建立稳定的、系统的技术规范才能在病毒筛查与预防病毒感染中广泛应用。

3.2 斑点金免疫结合法

斑点金免疫结合法是以微孔滤膜为载体，通过渗滤作用使抗原抗体快速进行反应。刘瑛等研究了斑点金免疫球蛋白结合法用于HAV的检测。该方法具有使用快捷、保留时间长的优点，但存在标本误读的现象，且成本高，准确度低，这两个因素限制了斑点金免疫法的广泛应用[9]。

3.3 近红外免疫层析技术法

近红外免疫层析法是将近红外荧光技术和荧光免疫层析技术相结合产生的一种新型侧向流技术，具有背景荧光量小、检测灵敏度高的优点。利用近红外荧光染料成功制备用于检测食品样品中甲肝病毒的近红外免疫层析试纸条[10]。

3.4 电化学免疫传感器法

电化学免疫传感器法是通过将抗体或抗原和电机组合而成的检测装置。该方法具有电化学稳定性好和生物选择性高的特点，目前已被成功地应用于水样分析中HAV值的测定。电化学免疫传感器可同时快速检测到各种类型的HAV抗原，虽然敏感度较高，但需要大批高品质的纳米金颗粒和蛋白质A，增加了检测成本[11]。

3.5 电镜观察法

电镜观察法具有直接、安全的优点，但病毒在电镜下的形态学特征并不突出，且灵敏度不高，同时对技术条件要求苛刻，因此无法直接应用于样品的检测[12]。

4 结语

因食用贝类产品而感染HAV已成为全球重要的公共卫生问题之一。因此，国内外相关的食源性HAV检测方法也在不断更新与完善。现如今贝类中HAV的检测方式日益多样化、深度化，在便利性、快速性和准确度等方面均有所突破。贝类属于低剂量病毒感染，病毒RNA的提取、检测方法都需要进一步创新研究。在此基础上，建立贝类的快速检测体系能有效防止感染HAV，避免暴发病毒感染事件。