缺氧诱导因子-1ɑ在缺血性心脏病治疗中的研究进展

翟淼浡 杜鑫 董彬昌 徐会圃

滨州医学院附属医院心血管内科，滨州 256600

近年来，随着人们生活水平的提高及生活习惯的改变，冠心病的发病率逐年上升，并有发病年龄年轻化的趋势，已成为我国中老年人群中常见病及主要死亡原因。急性心肌梗死是冠心病中最危重的一种，严重威胁着人们的健康。心肌梗死造成心肌细胞的死亡和心功能的损伤。随着急症溶栓和急诊经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）等技术的成熟和普及，急性心肌梗死的病死率呈逐年下降趋势，但心肌梗死所引起的心功能损害已成为临床心血管内科医师与心肌梗死患者所面对的主要问题。在急性心肌梗死中，心肌细胞的保护、梗死部位血管的再生、改善心肌细胞代谢已成为当前急性心肌梗死治疗策略中的重要组成部分［1］。在此背景下，如何在缺血、缺氧环境中尽可能保护心肌细胞已成为目前急性心肌梗死治疗的重要研究方向。

急性心肌梗死的主要病理过程是心肌细胞在急性缺氧环境中的坏死、凋亡，引起心脏电生理、机械活动异常，出现如心力衰竭、心律失常以及心脏破裂等一系列临床并发症。所以，急性心肌梗死的治疗核心即在缺氧环境中保护心肌细胞免于坏死和凋亡。在细胞和组织中，对低氧环境的适应是通过一系列相关基因的转录诱导实现的，这些基因参与了血管生成、铁代谢、葡萄糖代谢和细胞增殖/存活。而在一系列缺氧适应过程中，缺氧诱导因子-1ɑ（hypoxia-inducible factor-1ɑ，HIF-1ɑ）是关键调节因子，负责调控细胞和组织从常氧（～21%O2）到缺氧（～1%O2）的适应和生存［2-3］。HIF-1ɑ是一种对氧敏感的转录激活因子，最早是Semenza［3］在1922年发现的。相关研究表明，HIF-1ɑ不仅参与机体对低氧环境的适应调节，同时，在常氧环境下也具有重要的代谢调节作用，并参与胚胎发育过程。近年来，大量临床及动物研究显示HIF-1ɑ在动脉粥样硬化、急性心肌梗死、心肌保护等方面也发挥了重要作用。在急性心肌梗死患者中，HIF-1ɑ水平与患者预后及再发心血管事件概率呈现相关性，HIF-1ɑ水平较低组预后较差且再发心血管事件概率高［4］。目前，HIF-1ɑ在动脉粥样硬化、急性心肌梗死及心肌梗死后心肌保护等方面的作用已被广泛关注，探索其在未来心血管疾病的预防、诊断及治疗中的潜在影响已成为当前心血管疾病治疗中一大热点。本文主要就HIF-1ɑ的结构、生物学特性、调控机制以及HIF-1ɑ在动脉粥样硬化、急性心肌梗死等心血管疾病中的研究进展等方面作一综述，并进一步探讨HIF-1ɑ对未来急性心肌梗死诊断、治疗及预后评估方面的潜在价值。

HIF-1ɑ的结构及生物学特性

HIF-1是一种由低氧诱导亚基HIF-1ɑ（分子量为120kD）和一个组成性表达亚基HIF-1β（分子量为91～94 kD）组成的异二聚体复合物。其中ɑ亚单位为HIF-1的活性单位，其转录活性受细胞内氧浓度的调控，所以也是HIF-1的调节单位。而β亚单位在细胞中结构性表达，又称芳香烃受体核转运蛋白（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT），可作为芳香烃受体的配体［5］。HIF分子的ɑ亚单位包含1ɑ、2ɑ和3ɑ三个成员，其中HIF-1ɑ目前研究最为完善，并且广泛表达于各种细胞中。而HIF-2ɑ和HIF-3ɑ的表达则有明显的组织特异性，如HIF-2ɑ主要在管周成纤维细胞中表达，而成纤维细胞被认为是肾促红细胞生成素产生的原发部位，故而HIF-2ɑ在慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）的研究中关联较多。根据人类蛋白质图谱显示，3种亚型均在心肌组织中有所表达。HIF-1包含碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix-Per-ARNT-Sim，bHLH-PAS）、转录激活域（transactivation domains，TAD）和氧依赖性降解域（oxygen-dependent degradation domain，ODDD）3个功能结构域。bHLH和PAS基序是HIF-1ɑ和HIF-1β亚基形成异源二聚体的必需结构，其中bHLH还可与低氧反应元件（hypoxia response element，HRE）结合，启动下游基因［6］。HIF-2ɑ和HIF-3ɑ也属于bHLH-PAS超分子家族，在缺氧环境中起稳定作用并能与ARNT结合。在HIF-1异源二聚体中，HIF-1β亚基在组织细胞中结构性表达，其mRNA和蛋白均保持在恒定水平，而HIF-1ɑ的半衰期较短（t1/2，5 min），并受氧浓度的高度调控。事实上，HIF-1ɑ的合成也是连续的，且不受氧浓度的影响。但在常氧环境中，HIF-1ɑ迅速降解，故很难被检测到且不能发挥其转录激活作用。氧含量充足时，HIF-1ɑ在P402和P564的氧依赖降解域被脯氨酸羟化酶（PHD）修饰，羟基化的HIF-ɑ能与VHL肿瘤抑制蛋白结合，并作为E3泛素连接酶复合体的识别元件，通过蛋白酶体途径迅速被降解并失活，故而在常氧环境中胞质内HIF-1ɑ浓度极低，无法进入胞核并启动下游一系列目的基因的转录。在缺氧情况下，脯氨酸羟化酶活性被抑制，有研究显示，当氧浓度降低至120μmol/L时，其羟基化HIF-ɑ的能力被明显抑制［7］。在组织缺氧时，HIF-1ɑ变得稳定，并从胞质中向胞核内转移，在胞核内与HIF-1β形成二聚体，从而具有了转录活性。激活的HIF二聚体随后与靶基因调控区域的低氧反应元件（hypoxia response elements，HREs）结合，并结合转录共激活因子，诱导基因表达。值得注意的是，HIF-1ɑ也可以上调糖酵解酶和葡萄糖转运蛋白的表达，使细胞更加依赖糖酵解方式供能，提示HIF-1ɑ对细胞能量代谢也有调节作用。在心肌细胞中，绝大多数的HIF靶基因受HIF-1ɑ调控，受HIF-2ɑ调控者少见，而HIF-3ɑ在缺氧环境中的作用尚未明确。故HIF-1ɑ在心血管领域的前景受到广泛关注。

HIF-1ɑ的调控机制

1、HIF-1ɑ的翻译后修饰

对HIF-1ɑ的稳定性调控主要由其翻译后修饰控制，如羟基化、泛素化、乙酰化和磷酸化等过程［8］。关于HIF-1ɑ的修饰发生在多个结构域内。在常氧条件下，HIF-1ɑ氧依赖降解域中的两个脯氨酸残基的羟基化和一个赖氨酸残基的乙酰化可促进其与希佩尔林道肿瘤抑制蛋白（von-Hippel-Lindau tumor suppressor protein，pVHL）泛 素E3连接酶复合物的相互作用［9-10］。pVHL复合物用泛素标记HIF-1ɑ，泛素化的HIF-1ɑ可被26S蛋白酶体降解。C-TAD是反转录激活结构域，位于HIF-1ɑ蛋白的C端半区［11］。C-TAD已被证明可以与CBP/p300等共激活因子相互作用，激活基因转录。在HIF-1ɑ转录活性的调节中，C-TAD中天门冬酰胺残基的羟基化可抑制HIF-1ɑ与CBP/p300的相互作用，从而抑制了其转录活性。细胞质内合成的HIF-1ɑ被位于ODDD内的脯氨酸402（Pro402）和564（Pro564）上的2-氧戊二酸（2-OG）依赖性双加氧酶家族快速羟基化［12］。这2个脯氨酸残基的突变会破坏HIF-1ɑ与pVHL的相互作用，从而在正常氧水平下稳定胞质中的HIF-1ɑ。人类的HIF双加氧酶是PHD，并且存在3种亚型：PHD1，PHD2和PHD3。可以说，任何影响PHDs的因素都可以影响HIF-1的稳定性及其激活下游目标基因转录的能力。PHDs是一种2-OG依赖的双加氧酶，需要氧（O2）进行羟基化，以及Fe2+和抗坏血酸作为辅助因子。通过2-OG类似物灭活PHDs可以增加HIF-1的半衰期。观察研究发现，铁螯合剂及某些金属离子（如：Co2+，Ni2+，Mn2+）可以降低PHDs活性，稳定HIF-1，这可能是通过减少Fe2+对PHDs的可用性或与Fe2+竞争性结合相应结合位点来实现。同理，抗坏血酸有助于维持铁在亚铁（Fe2+）的状态，对于维持PHDs的活性具有重要意义，可以促进HIF-1ɑ的分解。在常氧环境中，PHDs激活，并使HIF-1的脯氨酸羟基化，促使HIF-1ɑ与pVHL结合并泛素化，最终导致HIF-1ɑ的降解。而在缺氧环境中，PHDs活性被抑制，HIF-1ɑ不能与pVHL结合及完成随后的泛素化，从而在胞质内积聚，继而向核内转移并与HIF-1β结合形成二聚体。由此可见，PHDs的绝对氧依赖性使其可以看作是细胞内的氧感受器。从pVHL角度来看，pVHL与蛋白elongin C、elongin B、cullin-2和Rbx1结合形成VCB-Cul2 E3连接酶复合物，并引起HIF-1ɑ的多聚泛素化，最终使其通过蛋白酶体途径降解。需要注意的是，pVHL途径并不是HIF-1ɑ唯一的降解途径，除了pVHL，许多其他蛋白已被报道影响HIF-1泛素化和稳定性。

2、反式激活域参与HIF-1ɑ的调控

上述HIF-1ɑ的翻译后修饰过程调节HIF-1ɑ蛋白的稳定性，但单靠稳定性调节并不足以使HIF-1ɑ完全转录激活。控制HIF活性的第二个主要机制是通过调节其反式激活域N-TAD和C-TAD。这些结构域通过招募转录辅激活子发挥作用，如CBP/p300、SRC-1和TIF2等。在正常氧分压条件下，FIH-1对HIF-1的C-TAD中的天冬酰胺残基803（Asn 803）进行羟基化，阻止了HIF-1与CBP/p300的相互作用，从而抑制HIF-1ɑ的转录激活功能［13］。缺氧消除了天冬酰胺羟基化，这使得HIF-1ɑ的C-TAD能够有效与CBP/p300相互作用，激活相应靶基因的转录。FIH-1主要位于细胞质中，但也有一部分可能位于细胞核中，而其转录活性与氧浓度无关，且不参与HIF-1稳定性的调节。但与PHDs一样，天冬酰胺基羟化酶FIH-1也是一种2-OG依赖性双加氧酶，也需要Fe2+和抗坏血酸作为辅助因子，而这种对于氧的依赖性使得FIH-1成为细胞中的另一个氧感受器。

3、HIF-1ɑ的其他调控途径

尽管羟化酶在感知氧张力和调节HIF-1活性方面具有中心重要性，但还有其他机制参与了HIF-1ɑ功能的调节。众所周知，磷酸化在蛋白质活性的调节中至关重要，目前，关于HIF-1ɑ的直接磷酸化已被报道，其中丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途径被广泛关注。相关研究表明，磷酸化并不影响HIF-1ɑ的稳定性或其与DNA的结合，相反，它增加了HIF-1ɑ的转录活性。其中一种可能的解释是，HIF-1β优先与HIF-1ɑ的磷酸化形式结合。除了氧浓度外，HIF-1ɑ也受某些非氧依赖方式进行调节，其中，细胞因子、生长因子、环境刺激和其他信号分子参与了非缺氧条件下HIF-1ɑ的调控。

HIF-1ɑ的生物学功能

因为HIF-1ɑ最初是在缺氧条件下发现，且主要在缺氧条件下被诱导表达，所以目前大部分关于HIF-1ɑ的研究都涉及缺氧环境。人体细胞和器官均需要适应内环境氧分压的变化，所以大量HIF-1靶基因是以组织特异性方式进行调节的。约89%的缺氧相关基因的表达共同受HIF-1ɑ的调控，迄今为止，已有100多个具有不同功能的HIF-1ɑ下游基因被鉴定。有研究发现，在动脉内皮细胞中，超过2%的人类基因直接或间接地受到HIF-1ɑ的调控。HIF-1ɑ的低氧适应作用主要体现在红细胞生成/铁代谢，血管生成，糖代谢，细胞增殖与凋亡等方面，而其中血管生成作用与心血管疾病关联紧密，受到广泛关注。

1、HIF-1ɑ参与血管生成

血管生成是一个复杂的过程，涉及由不同类型细胞表达的多种基因产物。在缺氧环境中，大量参与血管生成不同阶段的基因被激活，转录增加。其中，血管内皮生长因子（VEGF）作为最重要的内皮特异性有丝分裂原，通过招募内皮细胞进入缺氧和无血管区域，并刺激其增殖而直接参与了血管生成过程。此外，HIF-1ɑ也调节血管张力调控基因的表达，如：一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS2），血红素氧化酶-1，内皮素1（endothelin 1，ET1）等［14-15］。

2、HIF-1ɑ促进红细胞生成/铁代谢

在红细胞生成和铁代谢方面，HIF-1ɑ可以上调红细胞生成和铁代谢相关基因的表达，从而上调红细胞运输氧气的能力，以适应缺氧环境。其中，HIF-1ɑ调控的促红细胞生成素（EPO）表达上调起到了重要作用。HIF-1ɑ同时还上调转铁蛋白、转铁蛋白受体以及铜蓝蛋白基因的表达，促进铁离子的吸收，从而促进血红蛋白的合成，增加红细胞的携氧能力。

3、HIF-1ɑ调节葡萄糖应用途径及线粒体代谢

在低氧供应条件下，细胞的葡萄糖代谢途径从氧依赖的三羧酸循环转向不依赖氧的糖酵解缺氧。由于糖酵解途径中每个葡萄糖分子中只有2个三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）分子，而不是三糖酸循环提供的38个ATP，缺氧细胞必须通过增加葡萄糖摄取来提高其产生ATP的能力。在缺氧环境中，HIF-1ɑ通过上调糖酵解酶和葡萄糖转运体的表达来提高细胞对葡萄糖的摄取能力，保证细胞供氧，从而适应低氧环境。同时，HIF-1ɑ还可以抑制线粒体功能，从而降低细胞耗氧量，从另一方面促进细胞的缺氧适应能力。HIF-1ɑ可以通过3种机制调节线粒体的代谢活动。（1）HIF-1ɑ可以抑制丙酮酸脱氢酶激酶-1（pyruvate dehydrogenase kinase-1，PDK-1）的表达，限制丙酮酸进入线粒体，从而抑制线粒体的呼吸作用。（2）HIF-1ɑ可以通过改变细胞色素氧化酶复合物的组成来抑制线粒体呼吸；HIF-1ɑ通过诱导COX4-2和LON的表达，使线粒体呼吸在缺氧环境中效率提高。（3）HIF-1ɑ可以与c-myc联合作用，诱导HK 2的表达。HK 2是一种糖酵解酶，参与葡萄糖的非线粒体依赖代谢途径，并具有抗氧化作用。另有研究表示，在缺氧条件下，HIF-1ɑ还可通过丝裂原活化蛋白激酶依赖性途径被诱导表达并活化，引导缺氧条件下的细胞增殖率增加［16］，从另一角度调节组织对缺氧的适应过程。近期研究发现，HIF-1ɑ也可以在常氧环境下被生长因子、某些糖皮质激素和一氧化氮等诱导表达，但其所涉及的信号转导通路尚未明确。

4、HIF-1ɑ在胚胎发育中的调节作用

胚胎发育方面，在小鼠动物实验中发现，敲除HIF-1ɑ基因的小鼠出现心血管发育畸形以及妊娠中期的胚胎死亡［17］，提示HIF-1ɑ在胚胎心血管系统发育中起重要作用。另有研究发现间充质细胞的存活也需要HIF-1ɑ的参与，同之前实验结果一致，敲除HIF-1ɑ基因的小鼠会出现心血管系统及畸形和神经管缺陷，并于妊娠中期死亡。而杂合子基因小鼠（HIF-1ɑ+/-）可表现为发育正常，但是在慢性缺氧环境中表现出对缺氧的适应能力受损。

HIF-1与动脉粥样硬化

动脉粥样硬化是一种进行性动脉疾病，与急性心肌梗死联系紧密，不稳定硬化斑块破裂继发冠状动脉内血栓形成是急性心肌梗死的主要原因。动脉粥样硬化是由血管内皮细胞的损伤引起的，其特点是内膜中有低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）浸润。随后进入血管壁的单核细胞分化为巨噬细胞，摄取浸润的LDL后变为泡沫细胞，最终形成由纤维冒和脂质核心组成的粥样硬化斑块。巨噬细胞的进一步激活、细胞凋亡和活性氧的产生均可导致炎性反应，增加坏死核心含量并使纤维冒变薄，进一步促使动脉粥样硬化斑块进展。斑块内出血被认为是斑块进展和破裂的主要原因，是由于新形成的缺乏内皮完整性的微血管中的红细胞外渗所致。内皮细胞的完整性受到许多因素的影响，包括炎症介质、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）、VEGF和 促 血 管 生 成 素（Ang）-2与Ang-1的比值，其中一些重要因子的转录受HIF-1ɑ调控。HIF-1ɑ在缺血、缺氧和炎症条件的广泛生理反应过程中被激活，并在器官或组织对损伤的应激反应中发挥积极作用。目前，HIF-1ɑ在动脉粥样硬化发生中的作用存在一定争议。有研究发现粥样硬化斑块中的HIF-1ɑ表达上升，且与炎性反应、斑块表型有关；但另有研究显示在稳定型心绞痛及不稳定型心绞痛患者斑块中HIF-1ɑ的表达并没有显著差别［18］。有学者认为HIF-1ɑ参与动脉粥样硬化发生的主要途径之一是在斑块内血管生成中发挥作用。来自动脉粥样硬化斑块临床研究的证据表明，HIF-1ɑ在斑块内巨噬细胞和平滑肌细胞中表达，与VEGF共定位，并与血管生成密切相关［19-21］。这些血管允许脂质、炎性细胞和红细胞进入斑块，从而通过促进炎性反应和斑块内出血来促进斑块的进展［22］。另一方面，从一些体外研究来看，HIF-1ɑ可能在动脉粥样硬化发生中发挥不同作用。在体外研究中，巨噬细胞的活化、浸润和迁移均依赖于HIF-1ɑ。巨噬细胞对氧化的低密度脂蛋白的摄取可以诱导HIF-1ɑ积累，同时HIF-1ɑ又可促进泡沫细胞的形成［23］。在高胆固醇血症的动物模型中，动脉壁HIF-1ɑ水平的升高与MMP-2和MMP-9的上调相关，而这两种蛋白酶均可参与动脉粥样硬化斑块破裂［24］。这些试验结果提示HIF-1ɑ有促动脉粥样硬化作用。也有学者提出，细胞凋亡、细胞外基质代谢、炎性反应、血管生成以及脂质代谢等方面的基因也参与了硬化斑块的形成与进展过程，并均受HIF-1ɑ的调控，但尚未有体内试验的证据支持这种假设。综上所述，HIF-1ɑ在动脉粥样硬化的进展中发挥重要作用，但其具体机制尚未得到最终证实。

HIF-1ɑ在急性心肌梗死中的作用及机制

缺血性心脏病是发达国家的主要死亡原因之一。心肌缺血是由氧和葡萄糖的供需失衡造成的。当观察冠状动脉搭桥术中缺血或梗死患者的心室活检时，HIF-1ɑ及其下游基因的上调是最初的缺氧适应反应之一，并通过包括诱导血管生成在内的多种方式来适应缺氧环境。近年来研究发现，HIF-1ɑ与心血管疾病相关密切，特别是在急性缺血性心脏病中所起的心肌保护作用尤其显著。试验证明，HIF-1ɑ与缺血心肌冠状动脉侧支循环的形成有关。临床研究发现，在至少有一支冠状动脉闭塞70%且没有进行血运重建的患者中，HIF-1ɑ的表达与侧支循环数量呈正相关［25］。有证据表明冠状动脉侧支的程度与心肌梗死后梗死面积的减少相关［26-28］，HIF-1ɑ可能在心肌梗死后心肌保护方面发挥重要作用。在动物心肌缺血模型中，缺血诱导后心肌内注射HIF-1ɑ/VP16混合质粒可见明显的血管生成及心肌灌注改善，同时梗死面积明显减小［29］。同时，试验证明向梗死模型心脏左心室转导PHDs小干扰RNA，干扰PHD表达，以此来减少HIF-1ɑ降解，也可明显缩小心肌梗死面积并保护心室功能［30］。此外，有研究显示HIF-1ɑ还可能在心肌缺氧预处理内源性通路中起关键作用，作为内源性途径的关键因素，HIF-1ɑ可以在用于预处理预期缺血事件的患者。最后，HIF-1ɑ还可能在缺氧环境中调节心肌细胞葡萄糖的利用方式，保证心肌细胞缺氧环境中的能量供应，从而加强心肌细胞的缺氧适应能力。综上所述，这些结果表明，心肌梗死后HIF-1ɑ的表达上调可为最大化保护心肌及左心室功能提供一种新的潜在治疗选择。

HIF-1ɑ在急性心肌梗死早期诊断中的应用

随着生活环境和生活习惯的改变，急性心肌梗死发病率逐年上升，且发病年龄呈现年轻化趋势。目前临床主要的心肌坏死标志物有肌红蛋白、肌钙蛋白、肌酸激酶同工酶（CK-MB）等。我们的前期研究发现，急性心肌梗死早期HIF-1ɑ表达明显升高，且有较好的敏感性及特异性。因此我们认为，HIF-1ɑ可作为急性心肌梗死的炎症预测因子［31］，与肌钙蛋白、CK-MB等心肌损伤标志物联合诊断早期急性心肌梗死。

总结与展望

本文就HIF-1ɑ的功能、调控机制及其在动脉粥样硬化以及急性心肌梗死中的作用做一综述。HIF为异源二聚体，包含ɑ和β两个亚单位，其中HIF-1ɑ为其活性单位，也是其调节单位。HIF-1ɑ在组织细胞对缺氧环境的耐受、胚胎心血管系统发育、动脉粥样硬化及急性心肌梗死等一系列生理病理过程中起关键作用。随着HIF-1ɑ在生理适应及心肌保护中的作用越发明显，关于HIF-1ɑ在心血管领域的研究越来越受重视，为其参与临床急性心肌梗死治疗提供了大量经验与资料。另外，在急性心肌梗死的早期的诊断中，我们的前期研究证明急性心肌梗死时HIF-1ɑ表达明显上调，同时具有良好的敏感性和特异性，可能作为新的心肌损伤标志物联合肌红蛋白、肌钙蛋白、CK-MB等传统心肌标志物辅助临床心肌梗死患者的早期诊断。但HIF-1ɑ表达水平的高低是否与心肌梗死范围具有相关性仍有待于进一步试验与研究。随着新的研究结果的不断出现，相信HIF-1ɑ将在动脉粥样硬化以及急性心肌梗死治疗策略的制定中发挥重要的作用。