乙酰左旋肉碱对高锌诱导PK-15细胞凋亡的影响

杨庆稳,雍 康，张 怡，贺闪闪，杨钧杰,彭津津，聂青玉，吴有华*

(1.重庆三峡职业学院，重庆 万州 404155；2.广东海洋大学 农学院，广东 湛江 524088)

锌(zinc，Zn)是生物体必需的微量元素，其参与了机体大部分生理过程，如线粒体呼吸、免疫防御、DNA复制合成和铁代谢等[1]。然而，Zn一旦摄入过量可引起动物发生急慢性中毒[2]。研究指出，Zn毒性主要是通过在细胞中产生过量自由基以及激活NADPH氧化酶和一氧化氮合酶，同时抑制糖酵解和三羧酸循环相关酶，损伤线粒体中的电子传递链并加强质子漏，进而影响细胞正常代谢[3-4]。在实际养殖中发现，部分养殖户会在饲料中添加高水平的Zn以达到促生长的目的[5]。已有研究证实，长期使用高Zn饲料可增加动物体内Zn的积累，进而诱导肝脏、肾脏以及胰脏等组织发生病理变化，发生表观中毒病征[6-7]。

乙酰左旋肉碱(acetylL-carnitine，ALC)是机体中的一种左旋肉碱衍生物，可帮助脂肪酸进入线粒体并产生ATP[8]。据报道，ALC具有抗氧化、抗炎以及促进能量代谢等作用[8-9]，但其在Zn毒性中的作用及其机制仍鲜有报道。因此，本研究选用猪肾上皮细胞(PK-15)作为实验对象，采用ALC干预高Zn处理后的细胞，并检测细胞凋亡的相关指标，以此揭示ALC对高Zn诱导细胞凋亡的干预机制。

1 材料与方法

1.1 试验试剂和仪器七水硫酸锌(99.5%，Cas号：7446-20-0)购自阿拉丁化学试剂有限公司；ALC(99%，Cas号：5080-50-2)购自Santa Cruz公司；PK-15细胞由实验室保存； DMEM高糖培养基(Cas号：G4510-500ML)、胰酶(Cas号：G4001-100ML)和青链霉素(Cas号：G4003-100ML)购自武汉赛维尔生物科技有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(Cas号：164210-50)购自武汉普诺赛生命科技有限公司；CCK-8试剂盒(Cas号：CK04)购自日本同仁化学研究所；逆转录试剂盒HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(Cas号：R323-01)和荧光定量试剂盒ChamQTMUniversal SYBR®qPCR Master Mix(Cas号：Q711-02/03)购于诺唯赞生物科技有限公司；ECL发光液(Cas号：SB-WB001)购于上海圣尔生物科技有限公司；二喹啉甲酸(bincinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒(Cas号：P0010S),蛋白二抗(Cas号：A0208,A0192),RIPA裂解液(Cas号：P0013B),苯甲基磺酰胺(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)(Cas号：ST506)购自碧云天生物技术公司；Caspase-3(Cas号：9662)和cleaved Caspase-3抗体(Cas号：9661)购自Cell Signaling Technology公司；GAPDH抗体(Cas号：bs-0755R)购自北京博奥森生物技术有限公司。

荧光定量PCR仪(LightCycler480型)购自美国Roche公司；酶标仪(ELx808型)购自美国BioTeck公司；电泳仪(BG-Power600型)购自上海天能科技有限公司。

1.2 PK-15细胞培养PK-15细胞培养于含10% FBS和1%青链霉素的DMEM高糖培养基，于37℃、5% CO2恒温培养箱中进行培养。

1.3 细胞活力检测将细胞接种于96孔板中，当细胞生长至80%时，采用不同浓度的Zn2+(0，50，100，200,400 μmol/L)和ALC(0，25，50，100,200 mmol/L)进行细胞处理。细胞培养24 h后，加入CCK-8试剂孵育细胞1 h，采用酶标仪读取波长为450 nm的吸光度，并获取ALC的最佳处理浓度和Zn2+的半数抑制浓度。

1.4 细胞处理根据所得到的ALC的最佳处理浓度和Zn2+的半数抑制浓度，ALC处理量100 mmol/L，选择Zn2+处理量为120 μmol/L。因此，将细胞分为4组进行培养，分组如下：对照组(control group)、单独Zn处理组(Zn group)、Zn与ALC混合处理组(Zn+ALC group)和单独ALC处理组(ALC group)。

1.5 实时荧光定量PCR采用实时荧光定量PCR技术检测bax、bak-1、bcl-2和Caspase-3的mRNA表达。总RNA提取选用TRIzol法进行提取，提取的总RNA选用PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser试剂盒将RNA反转录为cDNA。从NCBI中获得bax、bak-1、bcl-2和Caspase-3的基因序列，并选用GAPDH基因作为内参基因。引物序列由Primer 5.0软件进行设计，最终由擎科生物科技有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

将反转录后的cDNA采用染料法进行RT-qPCR反应，反应体系为10 μL：ChamQTMUniversal SYBR©qPCR Master Mix 5 μL，cDNA 1 μL，上下游引物均为0.2 μL。反应条件：预变性95℃ 5 min；循环反应95℃ 10 s，60℃ 30 s，共进行40个循环；溶解曲线95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。所得出Ct值采用2-ΔΔCt法计算mRNA的表达。

1.6 免疫印迹细胞采用RIPA裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白含量。样本经过稀释至同一浓度后，与4×Loding Buffer进行混匀。随后蛋白样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转至PVDF膜上，经5%脱脂奶粉室温封闭1 h、蛋白一抗(Caspase-3和cleaved Caspase-3抗体均以1∶1 000稀释)4℃孵育16 h、二抗室温孵育1 h后，用ECL发光液显影，成像系统获取蛋白条带。

1.7 统计分析数据以平均数±标准差表示，采用Graphpad Prism软件对数据进行分析与图片绘制，组间比较分析采用单因素方差(ANOVA)分析进行检验，t检验分析2组之间的差异，不同字母表示显著差异。

2 结果

2.1 ALC最佳孵育浓度的选择由图1可知，PK-15细胞活力在ALC的处理浓度在0～100 mmol/L时呈现升高趋势，其中浓度为100 mmol/L时细胞活力显著高于0 mmol/L ALC组(P<0.05)。当ALC浓度达到200 mmol/L时，其细胞活力显著低于100 mmol/L ALC组(P<0.05)。由此，本研究选择了100 mmol/L浓度作为ALC孵育PK-15细胞的最佳浓度。

注：不同小写字母间表示差异显著(P<0.05)，下同

2.2 Zn2+半数抑制浓度的确定本研究通过对不同浓度的Zn2+进行细胞活力的检测，绘制出PK-15细胞在暴露于Zn2+中的细胞活力曲线。与对照组相比，50，100，200,400 μmol/L Zn2+中的细胞活力呈现显著下降(P<0.05)(图2)。经过计算，得出Zn2+在PK-15细胞中的半数抑制浓度为121.945 μmol/L。

图2 不同浓度的Zn2+对PK-15细胞活力的影响

2.3 Zn和ALC对PK-15细胞凋亡相关基因表达的影响如图3所示，细胞凋亡相关基因bax、bak-1和Caspase-3的mRNA表达在Zn组中较对照组显著升高(P<0.05)，Zn+ALC组中bax、bak-1和Caspase-3的mRNA表达与Zn组相比呈现显著下降(P<0.05)。此外，bcl-2的mRNA表达在Zn组中较对照组显著下降(P<0.05)，Zn+ALC组中bcl-2的mRNA表达与Zn组相比呈现显著升高趋势(P<0.05)。对照组和ALC组中的bax、bak-1、bcl-2和Caspase-3的mRNA表达无显著性差异(P>0.05)。

图3 Zn和ALC对PK-15细胞凋亡相关基因表达的影响

2.4 Zn和ALC对PK-15细胞凋亡相关蛋白表达如图4所示，Caspase-3的蛋白表达在Zn组中显著低于对照组(P<0.05)，而在Zn+ALC组中的表达则显著高于Zn组(P<0.05)。此外，cleaved Caspase-3的蛋白表达在Zn组中显著高于对照组(P<0.05)，而在Zn+ALC组中的表达则显著低于Zn组(P<0.05)。对照组和ALC组中Caspase-3和cleaved Caspase-3的蛋白表达未见显著性差异(P>0.05)。

A.免疫印迹条带图；B.蛋白表达的量化分析

3 讨论

Zn是一种必需微量元素，参与了多种生命过程[1]。在饲料中补充适量的Zn不仅可以提高动物繁殖性能、维持肠道微环境稳态，而且会提高抗氧化功能，提升机体免疫力[10]。然而，动物摄入过量的Zn可引起抗氧化功能下降，造成氧化应激以及程序性死亡的发生[11]。基于目前畜禽养殖行业中易出现重金属引起毒性损伤的问题，使得Zn元素在饲料中的运用得到更多关注。在本研究中，我们通过体外培养猪肾上皮细胞(PK-15)，采用Zn2+对细胞进行处理，由此评价其细胞毒性机理。研究发现，在孵育Zn2+浓度在100，200，400 μmol/L时，细胞活力显著下降，提示过量的Zn可导致PK-15细胞产生损伤。

大量研究证实，在重金属引起的细胞损伤中常伴随着细胞凋亡的发生[12-13]。凋亡是一种由多种基因高度调控的细胞程序性死亡，其特征是染色质缩合、DNA裂解和凋亡小体的形成。细胞凋亡的机制非常复杂，主要分为内源性和外源性2种途径[14]。其中，大部分研究主要集中于内源性细胞凋亡的探讨，线粒体途径的凋亡也成为了广大学者的研究热点。在大多数情况下，线粒体介导的内源性凋亡是由Bcl家族控制的，该家族是由bax和bak-1等促凋亡因子和抗凋亡因子bcl-2组成。当收到凋亡信号时，促凋亡蛋白会转移到线粒体膜上，Bcl-2蛋白进而下调，导致线粒体外膜通透，线粒体膜电位降低，释放膜间促凋亡物质，进而促使Caspase-3被剪切，并破坏细胞核结构，将细胞分解成凋亡小体[15]。已有研究证实，重金属元素可以诱导细胞凋亡的发生。LIAO等[14]研究证实，饲喂高剂量的铜可致使肉鸡肾脏bax、bak-1和Caspase-3的mRNA表达升高，进而发生线粒体途径的细胞凋亡；WANG等[16]研究也证实了钼和镉联合饲喂肉鸭也导致肾脏氧化应激和凋亡。本研究中，在Zn2+处理后，细胞凋亡相关基因bax、bak-1和Caspase-3的mRNA表达与对照组相比显著升高，且bcl-2的mRNA水平和Caspase-3蛋白表达显著下降，cleaved Caspase-3蛋白表达则显著升高。由此可得，过量的Zn可诱导PK-15细胞发生凋亡。

A.C是生物体内含量最丰富的左旋肉碱衍生物，是通过乙酰辅酶A和左旋肉碱在肉碱乙酰转运酶的催化生成[17]。ALC可防止脂肪酸和线粒体中乙酰辅酶A在细胞中的毒性积累，同时为线粒体中能量代谢提供足够的乙酰辅酶A[17]。已有研究证实，ALC在抗炎、抗氧化、抗凋亡及促进脂肪代谢等生物学作用。目前，关于ALC已在生殖系统疾病、阿兹海默症和肝性脑病等疾病中开展了相关的临床应用[18]。然而，关于ALC在治疗重金属中毒方面的相关研究目前尚不多见。本研究在猪肾上皮细胞(PK-15)中揭示了ALC对Zn毒性损伤的保护作用，结果显示Zn+ALC组中bax、bak-1和Caspase-3的mRNA表达显著低于Zn组，bcl-2的mRNA水平则高于Zn组。此外，Zn诱导下降的Caspase-3蛋白表达在ALC处理下呈现显著升高，而cleaved Caspase-3蛋白表达则显著降低。由此可得，ALC可显著缓解Zn诱导PK-15细胞的凋亡效应，这一结果也揭示了ALC对Zn诱导毒性损伤的保护作用，并为进一步挖掘Zn中毒的治疗提供重要方法。