食物中L-肉碱含量及其测定方法的研究进展

王 新，王秋举, ，刘洪健，王 宁，徐永平，马 悦，张东鸣,2,

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118；2.通化师范学院，吉林通化 134000；3.吉林省水产技术推广总站，吉林长春 130012；4.大连赛姆生物工程技术有限公司，辽宁大连 116620)

L-肉碱的首次发现是在上世纪初(1905年)[1]，从最开始的认知维生素Bt到现在所谓的功能全面的免疫增强剂已有百余年的历史。随着L-肉碱功能研究的不断深入，人们对L-肉碱的认识也逐渐增多。目前L-肉碱已被应用到养殖、食品、生物制药等多种行业中，不仅成为人们饮食当中不可缺少的营养物质，更是老年人、孕妇、病人等一些特殊人群的保健佳品。现已证明L-肉碱能加快细胞对脂肪的消耗，为人体提供能量，同时具有抗氧化、抗衰老和提高免疫力等功能[2]。因此，保证充足的L-肉碱的摄入量对于人体健康和疾病预防具有重要意义。人体中L-肉碱来源于日常膳食和自身合成两部分，日常膳食为L-肉碱的主要来源，约为75%[3]。因此，探明不同食物L-肉碱含量，建立合理的饮食结构来保证L-肉碱的基本需要，对于人类充分利用L-肉碱，保持健康至关重要。

L-肉碱几乎存在于所有动植物、细胞及微生物中，L-肉碱含量在不同物种间变化较大，而且即使在同物种间，可能也会因为不同的摄食类型和生活方式而产生较大差异。尤其是在动物组织中，L-肉碱含量会受到年龄、性别、营养、疾病等多种因素的影响。成年健康动物血液中L-肉碱含量与L-肉碱摄入量成正相关[4]。虽然世界各国对L-肉碱的生理、生化、营养和临床等方面进行了深入而广泛的研究，但国内对L-肉碱的研究相对较少，尤其是关于食物中L-肉碱含量及其测定方法的相关报道甚少[5]。因此，精确地测定L-肉碱含量，合理地利用食物中所含L-肉碱，对人类保健具有重要的意义。本文基于以往研究的结果，对食物中L-肉碱含量和测定方法进行整理和分析，为正确认识L-肉碱、外源摄食肉碱的人群提供基础理论依据，为优化L-肉碱检测方法并应用于实践提供参考数据。

1 食物中L-肉碱的含量

在哺乳类动物中，主要合成L-肉碱的部位是肝脏，此外在睾丸和肾脏中也能合成[6]。动物体中肌肉和心脏L-肉碱含量较高，人体98%的L-肉碱存在于肌肉和心脏中，其它组织中含量较少，血浆与肌肉L-肉碱浓度之比为1∶50[7]。鲜肉类食品L-肉碱含量最高(500～1200 mg/kg)，其次是鱼类、鸡肉和奶制品，而蔬菜、水果等植物性食品中L-肉碱含量最少[8]。通常情况下，多样化的饮食方式较为科学合理，能满足机体L-肉碱的需求，而素食者对L-肉碱的需求往往会增加。动物性食品、植物性食品、奶制品和鸡蛋中总L-肉碱及游离L-肉碱含量的存在情况分别见表1～表3。

表1 常见动物性食品中L-肉碱含量Table 1 L-Carnitine contents in the routine animal food

从表1可知，肉类中除脏器外总L-肉碱含量最高的是山羊肉(184.0 mg/100 g)，其次是袋鼠肉(166.0 mg/100 g)、骆驼肉(110.9 mg/100 g)、马肉(117 mg/100 g)、牛肉(95.3 mg/100 g)、鹿肉(74.0 mg/100 g)和猪肉(22.4 mg/100 g)。人类食物中L-肉碱的主要来源是肉类，与其它组织相比，多数动物的肌肉组织L-肉碱含量较高[9-10]。

蔬菜和水果中L-肉碱含量较少，除去皮后鳄梨(8.1 mg/100 g)和豌豆(5.7 mg/100 g)外，一般少于5 mg/100 g。黑醋栗、芦笋、黄瓜(去皮)、马铃薯(煮过)、树薯、西红柿、菠菜、粳米(煮后)、面条(煮后)中均未检测到L-肉碱，这就说明植物性食品中L-肉碱含量较少，这是由于大多数植物中缺少L-肉碱的前体——赖氨酸和蛋氨酸的原因[21]，具体含量见表2。

续表 1

表2 常见植物性食品中L-肉碱含量Table 2 L-Carnitine contents in the routine animal plant food

由表3可知，奶制品中L-肉碱的含量变化较大，酪乳(粉末)和明斯特乳酪L-肉碱含量相对较高[22]，分别是(22.5 mg/100 g)和(19.8 mg/100 g)，鸡蛋蛋白和卵黄中L-肉碱水平分别为(0.3 mg/100 g)、(0.8 mg/100 g)。奶制品L-肉碱含量的测定在不同的研究中出现了一定的差异，样品的测定方法和样品来源的动物及其年龄、饲养等因素均会影响奶制品中L-肉碱水平[11,23-24]。

表3 奶制食品和鸡蛋的L-肉碱含量Table 3 L-carnitine contents in the dairy products and eggs

人类营养学的研究表明，每个成年人身体中平均含有25 g/L-肉碱，建议每天应从饮食中摄取L-肉碱量为0.3～1.9 mg/kg[25]。平衡的饮食能为人体提供76.5 mg/L-肉碱，其中77.8%来源于肉类，14.4%来源于日常食物和蛋类[26]。饮食均衡的人群并不需要额外补充，食物中所含L-肉碱即可满足生理代谢的需要[27-28]。而素食主义者L-肉碱的摄取量约为16.2 mg，严格素食主义者L-肉碱的摄取量则小于16.2 mg，因此外源摄取L-肉碱含量则不能满足需要。虽然人体内存在L-肉碱的合成途径，但该途径极容易受到维生素C和二价铁离子的影响，所以对于素食主义者和严格素食主义者而言，由于所摄食的肉类较少，为满足机体需要势必要依赖L-肉碱的内源合成途径来保持L-肉碱的稳态，这就要求机体确保具有足够多L-肉碱合成的所有底物和辅酶因子，尤其是蛋氨酸、赖氨酸、维生素C、维生素B6和铁离子等[29]。

L-肉碱是安全无毒的小分子物质，被人体吸收后不会转化分解为其它物质，但是L-肉碱如果不能被肠道吸收，就会经肠道菌群及酶作用下分解产生氧化三甲胺。氧化三甲胺是三甲胺形成的N-氧化物[30]。近年来，氧化三甲胺在各种病理状态中的作用引起了广泛的关注。心血管疾病是导致人类死亡最主要的疾病之一，而动脉粥样硬化是造成心血管疾病形成的主要病理基础。因此，在满足机体需要的情况下，应避免摄食过量的肉类物质，避免过多的L-肉碱在肠道滞留，从而减少氧化三甲胺水平，保证身体健康[31-33]。

2 L-肉碱含量测定方法的研究

2.1 高效液相色谱法

高效液相色谱法主要分为直接测定和间接检测两种。衍生化反应是一种利用化学变换把化合物转化成类似化学结构的物质，一般来说，一个特定功能的化合物参与衍生反应，溶解度、沸点、熔点、聚集态或化学成分会产生偏离。由此产生的新的化学性质可用于量化或分离。离子对试剂法是通过电力能力较强的离子化合物与目标离子化合物形成中性的分子态物质，这样大大增强了该目标离子化合物的保留能力，便于检测。高效液相色谱法一般均通过衍生化反应和离子对试剂法进行间接检测，因用C18柱和C8柱可以分离γ-丁基甜菜碱和L-肉碱，但不能分离巴豆甜菜碱和L-肉碱，因此一般不采用高效液相色谱法直接检测。莫紫梅[34]利用离子对试剂法测定保健食品中L-肉碱含量得出该方法快速、准确、重复性好，可作为口服液类辅助降血脂保健食品的质量控制方法。李景华等[35]建立了测定降血脂药物中L-肉碱含量的简便方法，该方法操作简便、快速、有良好的准确度。临床上，人体血浆的样本可以用乙腈和甲醇混合液萃取出来，并用0.5 mL的硅胶柱进行分离，通过高效液相色谱法进行L-肉碱、乙酰肉碱的检测[36]。游离L-肉碱被衍化为紫外可以吸收的酯化形式，所形成的衍生物的稳定性，在不同时间内依然能通过HCLP进行检测。峰面积和浓度之间的线性关系为y=950.0x-104.2，r=0.9999，游离L-肉碱和总L-肉碱的批内和批间的相对标准偏差在1.23%和1.18%[37]。其他人的研究结果显示用这种方法所得到的精液中游离L-肉碱的回收率在91.6%～96.5%[38]。尿液中L-肉碱和酰基L-肉碱的测定方法被进一步的发展[39]，L-肉碱和酰基L-肉碱与荧光衍生试剂进行反应，通过液相的梯度洗脱进行测定[40]。棕榈酰L-肉碱和硬酯酰L-肉碱的分析恢复率在70%～76%，L-肉碱及其它酰基L-肉碱的恢复率在96%以上。Sun等[41]也是通过衍生化处理，并通过HCLP进行连续血样L-肉碱水平的测定，游离L-肉碱回收率为98.2%，总L-肉碱水平为96.3%。综合以上研究说明高效液相色谱法是一种操作简便、准确度高、重复性好的测定L-肉碱的方法且方法应用广泛。

2.2 质谱分析法

质谱分析法是一种有效且多功能的分析技术，它利用电磁学原理将化合物电离成具有不同质量的离子，然后按其质荷比的大小依次排列成谱收集和记录下来，因此，可以用来确定未知化合物成分、定量已知材料，并且阐述有机物和无机物的化学组成和分子结构[37]。质谱分析是一种敏感的分析方法，该方法具有较强的敏感性和专一性，可控性强，并且具有准确、快速、高效、高通量的优势。但是目前，由于成本较高，这种方法并未被多数实验室所采用，该法多用于临床上分析检测先天性L-肉碱代谢性障碍等疾病，而并非是对L-肉碱水平的定量。质谱分析法主要包括质谱串联法(MS/MS)、同位素稀释电喷雾与质谱串联法、液相色谱与串联质谱联合技术。

MS/MS方法可以测定低水平肉碱的样本,随着对质谱使用程度的增加，MS/MS方法测定血浆中游离肉碱和总肉碱逐渐得到发展和改良，即酸水解MS/MS法和碱水解MS/MS法，这些改良方法均提高了样本的检测速率和准确度[42]。同位素稀释电喷雾与质谱串联法使用快速原子轰击产生的电离作用而测定，只要求很少的样品准备时间和步骤，在专一性和准确性、精确度上与放射法一样好，并且更为方便有效[43]。现今已经越来越多的研究将液相色谱与串联质谱进行联合使用测定L-肉碱水平，与LCMS相比，LC-MS/MS具有更高的敏感性和专一性，但是成本要高很多，多数均是在医院实验室使用[44]。

2.3 电泳法

电泳法(CE)是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。CE检测系统包括直接和间接的紫外光、荧光、电化学和其他类型的检测器。但是，L-肉碱在紫外-可见光谱区的吸收是很弱的，并且缺乏荧光。直接分离方法不能测定L-肉碱水平，因此必须要进行衍生化处理[45]。但现在有研究将电泳技术与质谱技术(CE-MS)联合使用测定L-肉碱，取得了良好的效果。CE-MS的优势是不需要进行L-肉碱的衍生化反应，另外，该法杂质干扰的影响较小，电泳时间较短。这种方法是一种适合测定样品组分的理想方法[46]。但电泳法在实验室使用较少，因为程序比较复杂、可重复性低。

2.4 分光光度分析法

分光光度法是检测L-肉碱的传统方法，它是建立在酶反应的基础上，即以乙酰CoA和L-肉碱为反应底物，乙酰肉碱转移酶为催化剂，生成乙酰-L-肉碱后再与相应显色剂反应生成可检测的黄色产物(DTNB)，颜色深浅与L-肉碱水平在线性范围内呈正比，利用分光光度读取分光光度值，以此计算得到样本中的游离L-肉碱水平。

Matsumoto等[47]发明了一种荧光的方法，通过肉碱脱氢酶测定了不同年龄男性和女性血清中游离L-肉碱和酯酰L-肉碱水平，证实了L-肉碱随年龄的变化趋势和性别不同导致L-肉碱水平的差异。荧光光谱法测定L-肉碱的方法的优化，无外乎就是对各步骤进行最优化处理。Wan等[48]改良了一种方法，减少了成本，并且能在1 h内得到游离L-肉碱和总L-肉碱的结果。这种方法要求简单的两部样品准备的步骤，之后采用随机存取化学分析仪进行结果测定。该方法价格便宜，操作相对简单，不需要衍生化样本。但其检出限远远高于液相和质谱法等方法，而且酶反应过程中，酶易失活，样品制备复杂，操作时间长，杂散光干扰，可重复性与可控性差，不适合大量样品的快速检测。

2.5 放射分析法

放射-酶分析法是将乙酰CoA用C14标记，即[C14]乙酰CoA与L-肉碱反应生成[C14]乙酰L-肉碱和辅酶A(CoASH)，将乙酰L-肉碱从乙酰CoA中分离出来，并测定L-肉碱的含量[49]。由于一些限制性因素，如：特异性、线性范围、脱蛋白，原有的方法总是在被进行重复和改良，改良后的方法又具有了一定特性。Seline等[15]对放射-酶法测定L-肉碱含量进行了一些研究发现在分析过程中一些混合物具有放射性现象并对试验结果产生影响。除此之外，还测定了一些动植物样本中L-肉碱水平。在超过15 μmol/L时，线性关系均才是成立的，此方法可被用于测定肉类和蔬菜类中的总L-肉碱、游离L-肉碱和乙酰L-肉碱的量。

2.6 电化学法

电化学法创造了连续检测化合物的可能性，这种方法使用带有电化学传感器作为检测器的不同连续系统，获得了理想的测定效果。目前报道的有流动注射分析仪技术和顺序注射分析技术[50]。Isabel等[51]通过使用流动注射(FI)和固定的肉碱乙酰基转移酶生物反应器，对婴儿配方食品样品进行分析，以确定其游离L-肉碱含量。该方法基于分光光度法，通过与肉碱乙酰基转移酶、乙酰辅酶A和二硫代苯甲酸酯反应来进行。龚尚于等[52]采用流动注射-化学发光法测定减肥药物中L-肉碱含量，方法基于在碱性介质中，L-肉碱对Ag(Ⅲ)配合物-鲁米诺化学发光体系有显著的增敏作用，且化学发光强度在一定范围内与L-肉碱的浓度呈线性关系。电化学技术具有仪器设备简单、易于操作，灵敏度和准确度高，实用性强，易携带，且其费用较低等优点。

3 结语

L-肉碱因其特有的生理功能，在食品、医药等领域得到了越来越广泛的关注，因此对食物中L-肉碱的准确含量及其检测方法进行总结是十分必要的。本文详细地介绍了以往研究中食物L-肉碱的水平及检测方法，同时也对微生物代谢L-肉碱后所产生的有毒物质氧化三甲胺进行了分析，这为人们准确地掌握各种食物中L-肉碱含量及合理地利用L-肉碱提供了基础数据和建议。酶促反应与分光光度法联合使用是实验室常用的L-肉碱测定方法，但其精确度不足。随着仪器设备和分析方法的不断发展，高效液相色谱法、电泳法、质谱法、电化学法等检测L-肉碱的研究备受关注，这些方法选择性好、灵敏度高，但操作过程过于繁琐，因此，未来L-肉碱检测方法将会进一步的优化组合各种前处理方法和检测方法，向更加方便快速、更加准确、精确的方向发展。