乳铁蛋白生理活性及作用机理研究进展

张 雷，王文利，程智美，汪 雄，魏斯晗，王 洁，戴蕴平，张雅丽

(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100000)

乳铁蛋白(lactoferrin，LF)是一种非血红素球状铁结合糖蛋白，分子量大约为80 kDa[1]，1960年由科学家Montreuij和Johansonb首次从母乳中分离纯化出来后，受到广泛关注[2]。LF主要分布在哺乳动物乳汁和其他多种组织液中，如存在于粘膜分泌物中，包括眼泪、唾液、阴道分泌物[3]、精液、胃肠液、鼻腔分泌物、支气管分泌物、子宫分泌物等，以及胆汁和尿液等[4]。在嗜中性粒细胞、巨噬细胞和腺上皮细胞中也发现了LF的表达和分泌[5]。人乳中LF浓度约为1.0～3.2 g/L，是牛乳中的10倍，占普通母乳总蛋白的20%，人初乳中LF浓度甚至高达6～14 g/L[6]。由于LF有多种生理功能，比如：调节免疫反应、调节肠道菌群、调节糖脂代谢、抗菌、抗癌，因此其具有强大的应用价值和市场开发潜力，被社会各界广泛关注。

1 乳铁蛋白的结构

LF是由单一多肽链组成的一种糖蛋白，人乳铁蛋白(Human lactoferrin，hLF)和牛乳铁蛋白(Bovine laetoferrin，bLF)分别由691和696个氨基酸[7]组成，且不同物种间具有高度同源性。它由一条多肽链折叠成两个对称叶(N叶和C叶)，两个叶呈球状并具有类似折叠，具有一定的同源性。LF表面带正电，等电点为8.0～8.5。其N叶上存在LF最大正电荷区域，这一结构特征使得LF易于与阴离子结合。同时，其N末端有一杀菌区域，当该区域被水解释放时，能够形成破坏细胞膜的两亲性结构[8]。N叶与C叶之间通过一条α铰链连接，使得LF分子具有灵活性[3]。LF每个叶片包含一个铁结合位点，并与CO32-协同结合Fe2+或Fe3+以及Cu2+、Zn2+和Mn2+等金属离子[9]。由于LF能够可逆地结合Fe3+，因此其具有三种不同的三级结构：饱和型(holo-LF，结合两个Fe3+)、半饱和型(half-LF，结合一个Fe3+)、不饱和型(apo-LF，无Fe3+结合)[10]。apo-LF具有开放构象，具有更强的抗菌性，而holo-LF是一种封闭的分子，具有更强的蛋白水解抗性[11]。另外，LF糖基化的位点会影响LF对蛋白水解和热变性的敏感性[12]，并且有研究报道称许多病原体的发病机制依赖于与LF糖基的结合[13]。LF的N-聚糖主要是高甘露糖和N-乙酰葡糖胺[14]，在hLF中，大约5%的分子在一个位点被糖基化(Asn 479)，85%的分子在两个位点被糖基化(Asn138和Asn479)，9%的分子在三个位点被糖基化(Asn138,Asn479和Asn624)[15]。而在bLF中，也已经报道了5个潜在的糖基化位点，大多数bLF分子在Asn 233、281、368、476处被糖基化，只有15%～30%的LF分子利用Asn281糖基化位点[16]。

2 乳铁蛋白参与免疫系统

免疫系统可通过识别和响应多种免疫反应来保护机体免受潜在的有害环境刺激。LF因具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗癌、抗氧化等多种生物活性，在免疫系统中扮演着重要角色。

2.1 乳铁蛋白的抗炎作用

LF主要通过作用于免疫细胞和免疫因子，发挥免疫调节作用。淋巴细胞、单核白细胞、树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞(Natural killer cell，NK)等免疫细胞上有LF的特定受体，LF通过与这些免疫细胞的特异性受体相互作用，进行免疫调节。如：LF与树突状细胞相互作用可诱导其成熟[17]；与巨噬细胞相互作用可使其被激活，增强其吞噬能力和促进白介素-12(Interleukin-12，IL-12)的合成，IL-12是一种细胞因子，能吸引更多的巨噬细胞进入发炎的区域，并激活T CD4+淋巴细胞[18]；与NK作用可增强细胞活性和增加细胞数量，促进血液中多形核细胞(polymorphonuclear cell，PMN)的聚集，并诱导NK发挥吞噬作用[19]。LF还可刺激B淋巴细胞的分化和成熟，增强T淋巴细胞的表达，并促使抗原呈递细胞活化、成熟及向炎症区域迁移[1]。

当机体出现炎症反应时，LF还可调节细胞因子的表达来抑制机体炎症反应[20]。Li 等[21]发现LF通过下调NF-κβ通路，同时激活肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白细胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)的表达抑制脂多糖(Lipopolysaccharide ，LPS)诱导的小鼠子宫内膜炎；Aly等[22]发现用重组人乳铁蛋白(Recombinant human lactoferrin，RhLF)及其水解物处理Caco-2细胞可保护该细胞单层完整性，并减少IL-8和活性氧物质的产生，以此减轻LPS诱导的炎症；Kim等[23]也发现LF可降低LPS诱导的MC3T3-E1细胞中促炎细胞因子水平，同时减轻活性氧效应和炎症反应。

2.2 乳铁蛋白的抗菌作用

LF的抗菌机制大概分为以下四个方面：首先，早期大量的研究表明，多数微生物都需要铁才能生长，如铜绿假单胞菌[24]、阪崎肠杆菌[25]、大肠杆菌O157:H7[26]、金黄色葡萄球菌[8]等需要铁才能形成生物膜，而LF与铁的结合能力是转铁蛋白的300倍[27]，因此LF通过对铁的螯合作用能有效地抑制细菌生物膜的形成[28]。其次，LF N-末端带正电荷的肽片段可与革兰氏阴性菌外膜带负电荷的LPS产生静电相互作用，从而导致细菌外膜的结构紊乱，最终破坏细菌细胞膜通透性[29]。再次，当细菌感受到潜在的靶细胞后，会利用自身分泌的毒力蛋白复合物入侵细胞，而LF的N端具有丝氨酸蛋白酶功能，能够降解这些蛋白质[30]，从而阻止细菌与宿主细胞的结合[31-32]。最后，LF能通过竞争性结合目标细胞表面的膜糖胺聚糖来降低细菌的结合能力，从而防止细菌粘附到目标细胞[33]。

2.3 乳铁蛋白的抗病毒作用

近年来研究发现，LF对引起流感、病毒性胃肠炎、疱疹及人类免疫缺陷性疾病的病毒有一定抑制效果。在某些病毒的感染初期，如：丙型肝炎病毒(HCV)、巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒(HSV)和人类免疫缺陷病毒(HIV)，LF可通过直接附着病毒颗粒或阻断其细胞受体来抑制病毒颗粒进入宿主细胞[34,3]。LF还可通过诱导抗病毒细胞因子干扰素-α/β(interferon -α/β，IFN-α/β)的分泌来抑制小鼠诺如病毒对细胞的附着和病毒在细胞内的复制[35]。此外，LF还可增强NK细胞和Th1淋巴细胞的活性以增强机体免疫力，Th1淋巴细胞可分泌IFN-γ、IL-12、IL-18等细胞因子来保护机体免受某些病毒的感染，如LF对H1N1、H3N2和H5N1等流感病毒活性的抑制[36-37]。

2.4 乳铁蛋白的抑癌作用

国内外研究报道LF对最常见的五种癌症包括肺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌和乳腺癌都有一定的抑制作用[38]。LF的抑癌机制主要有以下几个方面：a.LF可增加血液中NK细胞和T细胞数量并促进T、B细胞的成熟，进而增强机体的免疫力[39]。b.LF可阻止癌细胞周期由G1期向S期过渡，使癌细胞进入生长停滞期，同时激活癌细胞内FAS信号途径，诱导癌细胞程序性死亡[40]。c.LF能抑制肿瘤新生血管生成。肿瘤新生血管的生成在肿瘤生长、转移的过程中具有重要的作用，如果没有新生的血管支持，肿瘤的生长就会停止。如：LF能抑制口腔癌细胞系CAL-27 细胞中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF) 、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)的转录和表达，进而抑制肿瘤组织血管生成，抑制口腔癌细胞增长和转移[41]。d.LF可破坏癌细胞膜结构从而诱导癌细胞的凋亡[42]。

2.5 乳铁蛋白与肠道健康

肠道作为一种人体重要的粘膜保护系统，其健康关乎身体各部分机能的正常运行。研究表明，LF可从改善肠道细胞、肠道炎症、肠道菌群等方面维持肠道健康。如：新生儿坏死性结肠炎(Necrotizing colitis，NEC)是由细菌或其毒素在肠道中引发的过度炎症反应，严重威胁新生儿健康。大量临床研究发现，给新生儿喂食LF后，NEC发病率与腹泻发病率远低于对照组[43-44]。这是由于LF可通过促进肠道成熟和肠细胞的增殖，从而关闭肠壁间隙连接点，防止肠壁泄露，维持肠道健康[45]。LF对肠道健康的维持还体现在以下几个方面，一方面，LF能促进小肠绒毛的发育，降低隐窝深度，从而提高小肠对营养物质的消化吸收能力，减少腹泻发生；另一方面，LF能提高血清中免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)、免疫球蛋白M(Immunoglobulin M，IgM)水平，降低促炎细胞因子IL-1β、IL-6的水平，并促进Th1、Th2的分化，维持肠道系统平衡，从而增强肠道黏膜免疫，保护肠道健康[46]。此外，LF还能降低肠道内大肠杆菌、沙门氏菌、肠杆菌、肠球菌的水平，增加乳酸菌和双歧杆菌等肠道益生菌的数量[47-48]，从而促进肠道微生物屏障的构建。

总的来说，LF在免疫系统调节中发挥着重要作用。LF通过作用于免疫细胞，调控免疫因子发挥抗炎作用；通过破坏细菌细胞膜的通透性，阻止细菌与细胞结合发挥抗菌作用；通过阻止病毒进入宿主细胞，增强免疫细胞活性发挥抗病毒作用；通过抑制癌细胞的增长以及促进癌细胞的凋亡发挥抗癌作用；以及通过改善肠道细胞、肠道炎症、肠道菌群等方面维持肠道健康。正是由于LF具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌等多种生物活性，决定了其在机体免疫调节上的重要地位。

3 乳铁蛋白改善神经系统

神经元是一种高度分化的细胞，是神经系统的基本结构和功能单位之一，它具有感受刺激和传导兴奋的功能。研究表明，当铁代谢和铁转运相关基因突变或缺失时，会引起脑中铁代谢紊乱，产生大量自由基[49]，导致氧化应激的发生而损伤神经系统，从而引起神经退行性病变，如阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease，AD)、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、多系统萎缩(Multiple system atrophy，MSA)，路易氏体痴呆(Dementia with lewy body，DLB)，肌萎缩性脊髓侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)，亨廷顿病(Huntington disease，HD)等。大量学者在衰老和神经退化的大脑中检测到较高水平的铁，这是由于这类退行性神经疾病中有不溶性蛋白聚集体的沉积，而这些聚集体会与铁发生共域化[50]。而LF作为铁转运蛋白，能够通过与铁的螯合作用来减轻氧化应激反应和改善铁代谢来保护神经系统，这在神经退行性疾病中被广泛研究。Mohamed 等[51]对AD患者每日给予LF治疗，3个月后发现LF通过调节p-Akt/PTEN通路，影响AD病理过程中的炎症和氧化应激，从而达到了减轻AD病理级联和缓解认知功能下降的效果。Martorell等[52]也发现LF可上调秀丽隐杆线虫体内过氧化氢酶(ctl-2)和谷胱甘肽过氧化物酶(gpx-1)的基因表达，具有保护秀丽隐杆线虫免受急性氧化应激损伤的能力。Xu等[53]在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的PD小鼠模型中发现，hLF减轻了MPTP引起的多巴胺能神经元神经元凋亡、神经炎症和组织学改变，同时抑制了MPTP诱导的铁的过度积累和二价金属转运蛋白(DMT1)和转铁蛋白受体(TFR)的上调，进而提高了几种抗氧化酶的活性，显著改善PD小鼠运动功能障碍。

LF还是人乳中最丰富的唾液酸化糖蛋白之一，其通过促进神经元分化与成熟，可增强大脑的认知功能和学习能力。环一磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)反应元件结合蛋白(cAMPresponse element binding protein，CREB)是神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)信号通路的下游靶点，是神经发育和认知中至关重要的蛋白，研究表明，LF可以上调仔猪海马脑源性BDNF的转录和翻译水平，增加CREB磷酸化水平，并上调神经可塑性、细胞迁移和祖细胞分化的标志物以及聚唾液酸的表达，促进轴突的生长和定位[54]。其次，Sriramoju等[55]的研究发现，LF可上调神经元分化因子(β-微管蛋白III，NF68-160-200，NSE)的表达并促进神经元分化，LF通过与特异性脂蛋白受体结合进而刺激胞内磷脂酰肌醇激酶(Phosphatidylinositol kinase，PI3K)和细胞外信号调节激酶(Extracellular signaling kinase，ERK)传导途径对神经元分化作用进行调节。另外，Wang[56]使用猪基因芯片对来自野猪的20201个基因进行了脑海马的全基因转录谱分析，发现喂食LF组与对照组相比共有1187个基因有差异表达，其中与细胞突起、微管动力学、神经突生长、细胞骨架形成以及焦虑相关的基因表达差异显著。

总的来说，LF对神经系统的改善可分为两方面：一方面，LF的铁螯合功能可减轻氧化应激反应，避免铁代谢紊乱导致的神经退行性疾病；另一方面，LF通过调节与神经发育和认知相关的几种典型信号通路促进神经元的分化和成熟。

4 乳铁蛋白调节糖脂代谢途径

动物研究和临床数据一致表明，无论是通过胃管注射还是口服LF，都可以减少肥胖小鼠和人类受试者的脂肪积累。近年来的研究进一步表明，LF可降低血浆与肝脏中甘油三酯和胆固醇含量，减少内脏脂肪积累[57]，还可有效防止高胆固醇血症和动脉粥样硬化的发生[58]。LF主要通过以下方式来调节糖脂代谢：

LF通过调节血浆中的厌食症激素浓度，如：空腹和餐后血糖浓度、空腹血清瘦素浓度及血浆胰岛素浓度等，来抑制食欲、改善能量平衡，以热量限制的方式降低体内脂肪含量[59]。Yagi等[60]将小鼠前脂肪细胞系MC3T3-G2 / PA6放入含LF的分化培养基中培养以诱导其分化，结果表明：LF通过下调诱导脂肪细胞分化的主要调节因子——过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(Peroxidosome proliferators activate receptors-γ，PPARγ)的表达，减少脂联素mRNA的表达，从而抑制脂肪细胞的分化。LF还能通过抑制脂肪酸合成酶、乙酰辅酶A羧化酶-α以及其他编码脂质合成酶基因的表达，来抑制前脂肪细胞中的脂质积累[61]。最新研究指出，LF可通过低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LDL receptor-associated protein 1, LRP1)受体激活成熟脂肪细胞的cAMP-PKA信号通路，蛋白激酶A (Protein kinase A，PKA)磷酸化后能够激活激素敏感性脂肪酶(Hormone sensitive lipase，HSL)，激活的HSL能够从细胞质进入脂滴中，开始脂解过程[62]。另外，Nakamura等[63]在研究中进一步发现，bLF与LRP1受体作用，通过cAMP-PKA信号通路促进了棕色脂肪细胞中解偶联蛋白1(Uncoupling protein 1，UCP1)基因的表达，该蛋白在棕色脂肪细胞的线粒体内膜上高表达并可消耗游离脂肪酸产生的能量，加快脂肪分解消耗。此外，bLF可通过调节肠道菌群、增加双歧杆菌的数量、促进肠杆菌属适度增长，以减少体重增加和脂肪储存，降低血液胆固醇和葡萄糖浓度，从而调节高脂饮食诱导的肥胖小鼠的脂糖代谢紊乱[64]。Moreno-Navarrrrete等[65-66]也发现，在II型糖尿病患者血液中LF含量与空腹血糖浓度呈负相关，而与胰岛素敏感性呈正相关，说明LF可能对糖代谢有一定的影响。

由此，LF调节糖脂代谢的途径主要可归纳为：a.抑制食欲，减少能量摄入；b.抑制脂肪细胞分化与脂质积累；c.加快成熟脂肪细胞内脂肪分解；d.改善肠道环境，从而调节糖脂代谢。

5 乳铁蛋白的其他生物活性

LF具有促进机体再生的功能以及多种酶的活性。LF对机体的再生属性体现在两方面：a.在骨中，LF可促进成骨细胞增殖和骨基质分泌，同时可抑制成骨细胞凋亡和破骨细胞生成[67]。如：Liu等[68]阐明了LF通过刺激ERK、c-Jun氨基末端激酶(c-JunNterminalkinase，JNK)、p38蛋白以及增强c-Fos和c-Jun基因的表达来诱导MC3T3-E1成骨细胞增殖；Amini等[69]的研究表明了rhLF能够通过Wnt5a /PKA途径介导对MC3T3前成骨细胞的抗凋亡作用；Devescovi等[70]的实验表明LPS与细胞表面受体结合诱导骨细胞发生骨质疏松和溶骨症时，LF能够通过和LPS竞争性结合来抑制LPS与细胞表面受体的相互作用，从而抑制破骨细胞的生成。此外，LF还能够调控骨再生过程中的信号分子， Nakajima[71]发现bLF可增加小鼠成骨细胞中管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factor-2，FGF-2)的表达。b.在软组织中，LF对成纤维细胞和角质形成细胞的增殖、迁移以及对细胞外基质成分(包括胶原蛋白和透明质酸)的合成有促进作用。LF能够通过参与炎症反应并促进皮肤肉芽和上皮形成来加快伤口愈合过程[5]。Tang等[72]利用猪烧伤创面模型研究了holo-RhLF对伤口再上皮化的影响，发现LF能够增强角质形成细胞的增殖和迁移并抑制细胞凋亡。

此外，LF具有DNA酶、RNA酶、ATP酶、磷酸酶、淀粉酶、过氧化物酶以及蛋白酶活性。Kanyshkova等[73]发现LF在水解RNA方面比14-kDa RNA酶更活跃；与IgG和sIgA抗体相比，LF在水解ATP方面也显示出更为活跃的特性。LF的不同配体可诱导单分子LF形成不同的特异构象，从而可调节其酶活性[74]。因此，LF是一种非常多功能的蛋白质，其多种酶活性可能会扩大其不同的生物学功能[75]，在未来研究中需深入了解。

6 乳铁蛋白的应用

LF因具有抗菌、抗炎、抗癌、抗病毒、抗氧化、再生属性以及酶活性等多种生理活性，被广泛应用于食品、动物生产、医疗、化妆品等领域，其可作为食品添加剂、保健品、免疫促进剂、药物载体等产品被应用。

LF最早于1982年应用在婴儿配方奶粉中，用于预防新生儿肠内感染以及促进婴儿铁的吸收[76]。后来其逐渐被添加在口香糖、化妆品、胶囊或饮料中用来治疗和预防铁缺乏症、腹泻、阿尔兹海默症及增强抗炎症能力等[77]。近年来，LF被列入食品添加剂[78]，将其添加到食品中以抗氧化和抑制细菌生长，如：延长大豆油等油脂的保质期。在医疗上，LF作为药物辅助剂，与药物协同治疗以增强药物疗效和减轻机体抗药性。目前，新兴的LF产品主要有：以LF为基础所制备的LF纳米粒子，其具有良好的热稳定性、更长的贮存时间和pH稳定性，因此LF纳米粒子能作为载体在食品中起到封装和保护铁等微量营养素的作用[79]，并且在药品中可起到缓释有效成分的作用。此外，多肽作为一种新的治疗手段引起了越来越多的关注，目前已有60多种多肽药物上市，科学家们也正在加紧LF多肽的临床研发。表1总结了国内外各行业利用乳铁蛋白生产功能性产品情况。

表1 不同行业产品对乳铁蛋白功效的利用[80-89]Table 1 Application of lactoferrinin different industries[80-89]

目前LF主要通过以下两种方式获得：其一，天然LF可以从几种哺乳动物的乳汁和初乳中分离纯化获得；其二，利用外源基因重组技术在动植物及微生物体内表达得到LF[40,90]。据调查，提纯1吨LF需要消耗至少14000吨鲜奶，因此从哺乳动物乳汁分离纯化得到LF的成本十分昂贵，工艺也较为复杂。而利用细菌、真菌、植物、动物细胞系和哺乳动物等表达系统生产LF，具有成本低、产量大等优势，在未来有望广泛应用于医药及营养等领域。

7 展望

近几十年来，日本一直将LF作为营养强化剂用于食品中，欧洲食品安全局近年也将其批准为食品成分，而在中国，LF也开始被作为食品添加剂投入生产，并通过了中国食品药品监督管理局(CFDA)的认证[91]。LF在体内有两种吸收方式，一种是以完整分子的形式进入体内，另一种是以分解肽段的形式被机体吸收，目前这两种形式与其各种生理活性还无法一一对应解释。因此需要更加深入地研究LF在动物机体的吸收、调节和作用机制，这将有助于理解LF作为食品在人体营养代谢中的关键作用。另外，近年来人们发现LF在脂代谢调节过程以及神经系统调节过程中发挥积极作用，但其作用方式和作用机制还并不清楚，这是未来可以继续深入研究的方向。总之，LF作为一种安全的天然营养物质，发掘其更深层次的生理活性机制有利于各行业对其更好地利用。