芹菜素通过NF-κB和MAPK通路抑制MAC-T细胞和小鼠乳腺的炎性反应

陈喜宏，余世田，马 骁，路桂聪，王瑞宏，玉永雄，蒋曹德*

(1.西南大学 动物科学技术学院，重庆 北碚 400715；2.城口县农业农村委员会，重庆 城口 405999)

牛乳腺炎是一种奶牛乳腺组织感染的顽固性疾病，其发病率高、治愈率低、淘汰率高。国内外奶牛场由于乳腺炎造成了乳制品产量和品质下降、治疗成本和牧场管理费用飙升，乳腺炎已成为限制全球奶牛产业发展的最重要原因之一[1]。当前奶牛乳房炎普遍采用抗生素疗法，不仅导致病原菌产生耐药性，而且乳汁中抗生素残留严重危害人类健康。植物提取物富含天然活性物质，具有无残留、无抗药性、多功能等优势，已广泛用作畜禽饲料添加剂[2]。研究植物提取物的抗炎作用，对于探讨奶牛乳房炎的抗生素替代疗法具有重要的理论和实践意义。

前期研究表明核因子κB(NF-κB)为经典的炎性反应通路，革兰阴性菌脂多糖(LPS)被toll 样受体4(TLR4) 识别后，激活NF-κB激酶(IKK)，导致NF-κB抑制蛋白(IκB)磷酸化和泛素化，从而释放NF-κB p65亚基并进入细胞核启动炎性因子与炎性介导因子的表达，其中包括白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧酶2(COX-2)等[3]。其他研究报道了促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路通过MAPK激酶的激酶—MAPK激酶—细胞外信号调节激酶(ERK1/2)、C-Jun 氨基端激酶(JNK1/2)和p38级联调控NF-κB、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧酶2(COX-2)等的表达[4-5]。MAPK和NF-κB信号通路在炎症发生中的重要作用已在小鼠乳腺上皮细胞[6-9]、RAW264.7细胞[10]、BV-2细胞[11]、人单核细胞[12]中得到广泛的证实。

芹菜素(apigenin，Api)即4′,5,7-三羟基黄酮，是一种天然的黄酮类物质[3]。芹菜素的抗炎抗氧化功能相继报道于小鼠结肠肿瘤与上皮细胞、牛的内皮细胞[13-15]。其他研究还揭示了芹菜素对NF-κB p65磷酸化、iNOS和COX-2的抑制作用[16-17]。目前在小鼠上皮细胞、内皮细胞与巨噬细胞中的研究集中在芹菜素的抗炎抗氧化作用，但是芹菜素对于MAPK通路和NF-κB通路的关键成员以及牛乳腺炎发生的调控功能还不清楚。因此，本研究选择牛的乳腺上皮细胞MAC-T和BME-UV1以及小鼠乳腺组织，分析芹菜素对细胞炎症反应的抑制作用及其抗炎的分子通路。

1 材料与方法

1.1 细胞培养MAC-T细胞(BMCC，CHN)培养于25 cm2的培养瓶中，DMEM基础培养液(Hyclone,Logan,SH30022.FS USA)含有10% FBS(Gibco，AUS)，1% 青链霉素和100 mg/L的链霉素(Solarbio，P1400-100 北京)；培养条件为37℃，5% CO2(Forma Series 3 WJ,Thermo,USA)。当细胞贴壁生长到90%时用0.25%胰酶(Solarbio,CAS:9002-07-7 北京)消化并传代。

1.2 细胞活性检测MAC-T细胞以1×104/孔的密度接种于96孔板上。待细胞贴壁后添加不同质量浓度(0，1，5，10，25，50，100，200 mg/L)的芹菜素(MCE，CAS No.:520-36-5,USA)处理并设置5个重复。细胞培养24 h后将上清液弃去并加入10 μL MTT(Solarbio，CHN)和90 μL DMEM基础培养液，继续培养4 h。然后，弃去培养液，再加入110 μL Formazan(Solarbio,CAS:298-96-4 北京)共同孵育10 min，用光密度计(Multiskan GO，Thermo，USA)检测D490 nm值。细胞活性=(处理组D值/对照组D值)×100%。

1.3 动物试验选取30只(20只雌性和10只雄性)6～8周龄BALB/c小鼠(伯恩斯韦尔生物技术有限公司，重庆)进行自由采食饲养。试验前采用在12 h光照与黑暗交替、无病原体条件下饲养1周。然后，每只笼子里饲养2只母鼠和1只公鼠进行交配。在母鼠分娩7 d后，将哺乳期的母鼠随机分成4组：空白对照组、LPS组(10 μg)、LPS+Api (15 mg)和Api+LPS[18]。LPS (200 mg/L，50 μL)溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中，用32G针注射到最容易观察和采集的第4对乳头(R4和L4)的乳腺导管中[9,18]。LPS组的每只哺乳期小鼠用9 μL 4%水合氯醛深度麻醉，在脂多糖滴注前、后1 h腹腔注射芹菜素[9]。空白对照组和LPS组腹腔注射等体积的PBS。注射LPS 24 h后[18]，通过颈椎脱臼处死小鼠，收集乳腺组织并储存在-80℃。

1.4 总RNA的提取与real-time PCR MAC-T细胞按照2×106/孔接种于6孔板中，贴壁后按照不同实验进行不同处理。为筛选LPS处理的最佳时间与质量浓度，MAC-T细胞培养在含有不同质量浓度LPS(Acmec，AL8880 CHN)(0，1，5，10，20 mg/L)的培养液中，并在1，12和24 h分别收集细胞，试验设置3个独立重复试验。对于芹菜素的处理，MAC-T细胞培养在含有不同质量浓度芹菜素(0(阴性对照)，1，7和15 mg/L)和1 mg/L LPS的培养液中，并以20 mg/L DEX(dexamethasone)(Macklin，D807084 CHN)和1 mg/L LPS共处理作为阳性对照。培养24 h后收集细胞，每个处理设置3个重复。各种处理收集的细胞均用PBS润洗3次，每孔加入600 μL RNAiso plus(TaKaRa，D9108A JPN)充分裂解后转移至无核酶离心管中，加入1/5 RNAiso plus体积的氯仿，充分混匀后室温静置5 min；4℃ 12 000 r/min离心15 min，吸取上清液至新的无核酶离心管，加入等体积异丙醇后混匀并于-20℃沉淀30 min；4℃ 12 000 r/min离心10 min 收集RNA沉淀，75%乙醇清洗RNA沉淀2次后干燥，并加入20 μL DEPC水溶解RNA沉淀，用超微量分光光度计(NanoDrop One，Thermo，USA)测定RNA浓度。

按照mRNA反转录试剂盒(江苏楚天生物科技有限公司，常州)说明书进行反转录。利用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ (宝生物工程(大连)有限公司)在CFX96(Bio-Rad，USA)热反应仪上进行real-time PCR反应。除了各引物退火温度见表1，real-time PCR反应体系、热循环程序和60～95℃熔融曲线分析参照文献[19]。每个PCR反应3次重复，以β- actin为内参基因，采用2-△△Ct方法计算基因相对表达量[20-21]。

表1 荧光定量引物序列

1.5 Western blotMAC-T 细胞按照2×106/孔接种于6孔板中待其贴壁，随后培养在含有不同质量浓度芹菜素(0，1，7和15 mg/L)和1 mg/L LPS的培养液中，24 h后收集细胞。细胞总蛋白提取采用细胞总蛋白提取试剂盒(Solarbio，R0020 北京)，随后用BCA蛋白定量试剂盒(Vazyme，ml058939 南京)进行总蛋白定量。取4 μL蛋白样品加入16 μL上样缓冲液(Solarbio，P1040 北京)后煮沸变性5 min，随后采用10% SDS-PAGE(PowerPac HC，Bio-Rad，USA)。电泳条带通过转印设备(1703812，Bio-rad，USA)转移到PVDF膜(Biosharp，AP-4796 上海)，在含有5%牛血清白蛋白(Biotopped，北京)的封闭液中室温封闭1 h后，进一步与一抗4℃孵育过夜，其中一抗包括β-actin(bsm-33036M；稀释比1∶10 000)，p65(bs-23217R，稀释比1∶1 000)，p-p65(bs-0982R，稀释比1∶1 000)，IκBα(bs-1287R；稀释比1∶1 000)，p-IκBα(bs-2513R，稀释比1∶1 000)，ERK1/2(bs-2637R，稀释比1:1 000)，p-ERK1/2(bs-3016R，稀释比1:1 000)(Bioss，北京)以及JNK1/2(WL01295，稀释比1∶750)，p-JNK1/2(WL01813C，稀释比1∶750)，p38(WL00764，稀释比1∶750)和p-p38(WLP1576，稀释比1∶750)(Wanleibio，沈阳)。上述一抗杂交膜经TBST洗涤3次后，与特异性二抗(AB501-01A，Novoprotein，北京)室温孵育1 h。用ECL化学发光系统(Gel Doc XR，Bio-Rad，USA)检测目标条带，并使用Image Lab (version 5.2.1,Bio-Rad,USA)和GraphPad Prism(version 8.2)进行定量分析。每个实验设置3次重复，以20 mg/LDEX和1 mg/L LPS共处理作为阳性对照。

1.6 免疫细胞荧光将MAC-T细胞以1×104/孔的密度接种于96孔板并设置5个重复，待其贴壁后将MAC-T细胞培养在含有不同质量浓度芹菜素(0(阴性对照)，1，7，15 mg/L)和1 mg/L LPS的培养液中培养24 h，并以20 mg/L DEX和1 mg/L LPS共处理作为阳性对照。培养结束后弃上清，PBS润洗3次，免疫染色固定液固定10 min；PBS洗涤3次，免疫染色封闭液室温封闭1 h，加入一抗(p-p65和 p-IκB)4℃孵育过夜；加入Cy3标记的二抗即羊抗兔免疫球蛋白(SN368，Beyotime，上海)室温孵育1 h，用PBS洗涤3次后加入20 μL细胞核染色液DAPI(4’,6-diamidino-2-phenylindole)染色10 min；用PBS洗涤3次加入适量免疫染色封片液，在倒置荧光显微镜下观察。

1.7 酶联免疫吸附试验(ELISA)对于炎症细胞因子和氧化应激因子的检测，使用无菌注射器从4个治疗组的小鼠中提取5 mL血液，储存在10 mL含有0.1 mL肝素钠(10 g/L盐水溶液)的离心管中，并在4℃下以3 000 r/min离心30 min。为了测试p-p65核转移，在6孔板中培养和处理MAC-T和BME-UV1细胞，使用核蛋白提取试剂盒提取细胞核蛋白，并使用BCA蛋白定量试剂盒(Vazyme，ml058939 南京)进行定量。采用酶联免疫试剂盒(游喧，上海)检测血液上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α的含量，以及细胞核中p-p65的含量。每个酶联免疫吸附反应进行3次。

2 结果

2.1 芹菜素对MAC-T细胞活性的影响随着芹菜素处理浓度的增加，MAC-T细胞活性表现为先提高后下降，在芹菜素质量浓度为7 mg/L时细胞增殖显著高于其他质量浓度(P<0.01)，当质量浓度超过20 mg/L时细胞增殖显著下降(P<0.05)。因此，确定芹菜素的适宜处理质量浓度为1～15 mg/L。

图1 芹菜素处理对MAC-T细胞活性的影响

2.2 LPS诱导的MAC-T细胞炎症反应为筛选引起炎症反应的LPS质量浓度，分析了不同质量浓度的LPS处理组和未处理对照组MAC-T细胞中IL-6 mRNA表达水平。与处理1～24 h后的对照相比，在用1～20 mg/L LPS处理的MAC-T细胞中，IL-6转录水平具有剂量和时间依赖性 (P<0.01，图2A)。而且，在1 mg/L LPS处理的细胞中，IL-1β和TNF-α的mRNA表达显著升高(P<0.01,图2B-F)。因此，根据文献选择1 mg/L LPS进行后继研究[20]。

2.3 芹菜素对LPS诱导的MAC-T炎性反应与氧化应激的抑制作用为检测芹菜素的抗炎和抗氧化作用，采用不同质量浓度的芹菜素和1 mg/LLPS共处理MAC-T细胞。如图2所示，1，7 和15 mg/L 3种质量浓度的Api处理均显著降低了LPS诱导的COX-2、iNOS、IL-1β和IL-6 mRNA的表达量，而且除TNF-α(P>0.05)外，其他细胞因子的表示水平也显著低于DEX处理组(P<0.01，图2B-F)。

注：图A中不同大写字母表示P<0.01，相同大写字母之间表示P<0.05；图B中#和##分别表示与空白对照组比较P<0.05 和P<0.01，*和**分别表示与LPS处理组比较P<0.05和P<0.01。下同

2.4 芹菜素对MAC-T细胞NF-kB信号通路关键蛋白磷酸化的抑制利用Western blot检测了芹菜素对NF-κB信号通路关键成员p65和IκBα的磷酸化的影响(图3)。与对照组相比，LPS处理后MAC-T细胞p65和IκBα蛋白质水平没有差异(图3A)，但是它们的磷酸化显著上调(P<0.05)(图3B、C)。相反，1，7，15 mg/L的芹菜素处理均极显著下调了LPS诱导的MAC-T细胞p65和的磷酸化水平(P<0.01)，而且芹菜素对p-p65和p-IκBα抑制程度呈现剂量依赖效应。各质量浓度芹菜素处理后，p-p65和p-IκBα水平也显著低于DEX处理组(P<0.05)。同样，LPS与LPS共处理可显著降低BME-UV1细胞中LPS诱导的p-IκB和p-p65水平(P<0.01)。

A.Western blot结果；B～C.不同质量浓度芹菜素处理24 h后LPS诱导的p65和IκBα磷酸化蛋白表达量

进一步检测了芹菜素对LPS诱导的p65核转移的影响(图4)。在对照组(Control)中，p65蛋白主要集中在细胞质中(图4A～C)；经过LPS处理后，p65蛋白转移进入细胞核(图4D～F)。相反，芹菜素与LPS共处理后，3种质量浓度的芹菜素(1，7，15 mg/L)处理均能抑制p65核转移(图4J-R)。

图中蓝色荧光为细胞核，红色荧光为p65蛋白；Merge为红色和蓝色荧光叠加

2.5 芹菜素对MAC-T细胞MAPK信号通路相关蛋白磷酸化的抑制前期文献报道MAPK是激活NF-κB和促炎调节因子的关键级联通路[6]，因此检测了芹菜素对MAPK通路关键成员p38、JNK1/2和ERK1/2的磷酸化水平的影响(图5)。LPS处理后，p38、JNK1/2和ERK1/2的磷酸化水平较阴性对照组都有极显著的提高(P<0.01)(图5B-D)。然而，1，7，15 mg/L芹菜素处理后，上述3个蛋白激酶的磷酸化水平极显著下降(P<0.01)，其中p38的磷酸化下降程度呈现芹菜素剂量依赖效应(图5B)，并且p38和ERK1/2的磷酸化在各种质量浓度芹菜素处理下都显著低于DEX处理(P<0.01)(图5B、D)。

图5 芹菜素对MAPK信号通路的抑制

2.6 芹菜素对LPS诱导的小鼠乳腺炎性细胞因子与氧化应激因子表达的抑制利用小鼠乳腺探讨了芹菜素对LPS诱导的炎症反应以及NF-κB和MAPK通路的影响。ELISA分析显示，与空白对照组相比，LPS显著提高了促炎细胞因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)和氧化应激因子(COX-2和iNOS)的血液蛋白水平(P<0.05，图6)，但是芹菜素前处理(Api + LPS)和后处理(LPS + Api)均极显著下调了5种细胞因子的表达(P<0.01)。Western blot显示，芹菜素前处理与后处理均显著抑制了LPS诱导的NF-κB磷酸化水平(p-IκB和p-p65)(P<0.05，图7)和MAPK磷酸化 (p-p38、p-JNK1/2和P-ERK1/2)(P<0.05，图8)。这些结果与体外结果一致，进一步证实了芹菜素的抗炎作用。

图6 芹菜素对小鼠炎症反应的影响

图7 芹菜素对小鼠NF-κB通路的影响

图8 芹菜素对小鼠MAPK信号通路的影响

3 讨论

本研究利用LPS处理MAC-T细胞揭示芹菜素的抗炎作用。MAC-T细胞是表达猴病毒-40的大T抗原的牛乳腺上皮细胞，由于其与原代细胞具有相似的生物学反应，常被用作研究牛乳腺炎症的模型[20]。因此，本研究选择该细胞系来研究芹菜素对MAC-T细胞炎症反应的影响。

大肠杆菌和金黄色葡萄球菌是引起牛乳腺炎常见的病原体，但是大肠杆菌引发急性临床症状，并激活机体免疫反应，包括细胞因子和趋化因子等的表达[6,21]。LPS是大肠杆菌细胞壁的主要成分，通过TLR4/NF-κB级联激活炎症反应[22]。另一方面，DEX是一种广泛用于治疗人类炎症性疾病以及LPS诱导的动物模型和体内实验的类固醇药物。因而，本研究建立了空白、LPS和LPS + DEX对照，通过LPS组与空白对照组比较，揭示LPS诱导的炎症反应；通过比较LPS +Api、LPS + Api与LPS、LPS + DEX处理差异，揭示芹菜素的抗炎作用。

研究表明LPS激活TNF-α、IL-6和IL-1β等炎性细胞因子的表达，导致牛乳腺腺组织严重损伤[6,23]。在RAW264.7、肾小管上皮细胞和肠道炎症疾病中的研究发现，芹菜素能降低LPS诱导的IL-6、IL-1β和TNF-α的表达[6,17,24]。本研究发现芹菜素不仅降低LPS诱导的IL-1β和IL-6的表达，而且还抑制了炎症介导因子COX-2和iNOS的表达(图3)，这与芹菜素在HepG2细胞炎症和前列腺癌细胞中降低COX-2和iNOS的mRNA水平相一致[25-26]。实际上，COX-2是一种诱导酶，其表达受IL-1、IL-6等细胞因子和生长因子的调控，该炎性介导因子的表达是前列腺素刺激的关键步骤[27]。iNOS是一种一氧化氮合酶，被炎症、组织损伤等病理刺激激活，抑制iNOS对降低炎症介质NO水平至关重要[27]。因此，COX-2和iNOS均是炎症标志物，它们的表达与氧化应激和炎症的发生密切相关。本研究中数据表明，芹菜素的抗氧化和抗炎作用是通过下调IL-6、IL-1β、iNOS和COX-2的表达来实现的。

NF-κB在LPS诱导的肺部和巨噬细胞炎症中起着关键作用[18-19]。桑色素、荷叶碱和皂苷等植物提取物通过阻断NF-κB信号发挥炎症的抑制作用[5,28-29]。NF-κB是细胞中广泛存在的转录因子，主要由p50和p65复合物组成，在静息状态下与抑制性蛋白IκBα结合而失去活性[22]。LPS刺激后，IκBα通过磷酸化和泛素化被降解并释放p-p65，随后迁移到细胞核参与COX-2、TNF-α、IL-6和IL-1β等靶基因的转录激活[23]。有研究报道，在内皮细胞炎症中，芹菜素能抑制p-p65和p-IκB的表达量以及p-p65的核积累[30]，但过表达IKK能解除芹菜素对NF-κB p65磷酸化的抑制[30]。本研究从体外和在体研究均发现芹菜素能显著降低p-IκBα和p-p65水平以及p-p65核移位(图4、7)。这些结果说明芹菜素能通过抑制IκBα降解和p65激活减轻LPS诱导的炎性反应。

已有文献表明MAPK信号通路通过iNOS、COX-2等炎性介导因子促进炎性细胞氧化应激反应[6,30]。MAPK信号包含3个MAP激酶，即ERK1/2、JNK1/2和p38，这些酶存在于所有的真核细胞中。本研究中，芹菜素抑制了MAC-T细胞炎症中p-ERK1/2、p-JNK1/2和p-p38水平(图5、8)，此研究结果证实了小鼠、大鼠以及HK-2细胞中的研究结果[32-34]，说明芹菜素的抗氧化活性与MAPK信号通路活性的抑制有关。

综上所述，本研究表明芹菜素能降低MAC-T细胞中LPS诱导的炎性细胞因子IL-6、IL-1β和炎性介导因子COX-2、iNOS的表达；芹菜素通过抑制NF-κB和MAPK信号通路抑制MAC-T细胞炎性反应，但是其奶牛乳腺炎防治中的应用有待进一步研究。