体外诊断试剂稳定性研究的影响因素和评价要求

仉琪，曹学芬，李耀华

1.国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心，北京 100081；2.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250011

体外诊断试剂是指在疾病的预测、预防、诊断、治疗监测、预后观察和健康状态评价的过程中，用于人体样本体外检测的试剂、试剂盒、校准品、质控品等产品，可单独使用，也可与仪器、器具、设备或系统组合使用［1］。其中，用于血源筛查的体外诊断试剂和采用放射性核素标记的体外诊断试剂按照药品进行管理，其他体外诊断试剂按照医疗器械进行管理。体外诊断试剂稳定性是指产品在生产企业规定的条件下储存，在规定的时间内保持其性能特性的能力［2］，主要包括实时稳定性、运输稳定性、开瓶稳定性、冻融稳定性、机载稳定性、复溶稳定性（冻干产品）等［3］。稳定性作为评价体外诊断试剂保持产品性能的重要指标，对产品的研发、生产、运输、保存和使用等环节具有重要意义，通过稳定性研究可以评价和调整产品组方、工艺、包装材料等，确定产品的保存期限和开封后保存期限，明确产品的运输、储存和开封后的保存条件，并可在产品保存期限和储存条件等发生变更时，验证变更后的产品稳定性［4］。本文主要对按照医疗器械管理的体外诊断试剂稳定性的研究方法和评价要求进行概述。

1 适用法规

1.1 我国的法规要求 根据国家市场监督管理总局在2021 年发布的《体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式》，体外诊断试剂的稳定性研究应提交至少3 批申报产品在实际储存条件下保存至成品有效期后的实时稳定性研究资料，明确储存环境条件（如温度、湿度和光照）及有效期［5］。上述规定是体外诊断试剂产品注册资料中稳定性研究的审评依据，规定了实时稳定性研究的要求、批次和条件等，但对具体的研究方法及内容并未进行详细规定。2018 年，国家药品监督管理局公布了YY／T 1579-2018《体外诊断医疗器械体外诊断试剂稳定性评价》［6］，规定产品稳定性评价的通用要求，包括对实时稳定性和加速稳定性的具体要求，于2019 年3月1 日起实施。

同时在申报和上市阶段，生产企业应依据产品研制、生产阶段对产品稳定性的研究结果，将产品稳定性信息载明于产品说明书和产品标签上。根据《体外诊断试剂说明书编写指导原则》要求，产品说明书中储存条件及有效期项应载明产品储存条件及有效期，同时还应明确产品的开瓶稳定性、机载稳定性、冻融稳定性、复溶稳定性等内容。产品标签中至少应载明产品储存条件及有效期。针对有特殊储存条件要求的产品，应在产品说明书及标签中明确，如阴凉、避光、直立等［7］。

产品稳定性作为产品重要的性能指标，生产企业应在产品研发和设计阶段进行充分验证，具体也可以参考国家药品监督管理局于2015 年发布的《生物制品稳定性研究技术指导原则（试行）》［8］。由于稳定性研究持续时间较长，生产企业也可在产品上市后继续进行稳定研究，通过变更注册提供充分的研究资料来延长产品有效期。

1.2 可参考的国际要求 国际上关于体外诊断试剂稳定性的基本要求与我国一致，要求注册申请人提供随着时间的推移及产品所处环境的变化，产品性能退化对产品安全有效的影响等研究资料。

美国FDA 于1991 年发布了指导原则《医疗器械货架寿命》［9］，提供了稳定性研究的考虑因素和验证原则，但未涉及具体的验证方法和测试项目。美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）于2009 年发布了《体外诊断试剂稳定性评估指南》（EP25-A Evaluation of Stability of In Vitro Diagnostic Reagents），为定量和定性体外诊断试剂提供了稳定性研究的指导［10］。该指南包括制定特定产品的稳定性测试计划时要考虑的背景信息和典型内容、操作方法、数据分析及研究资料的归档，还包括产品运输条件的评估，稳定性监测（验证）及加速稳定性试验的使用［11］。欧洲标准化委员会（Commission for European Normalization，EN）于2002 年发布医疗器械指南性文件《体外诊断试剂的稳定性试验》（EN 13640：2002）［12］，该文件执行十几年后，国际标准化委员会于2011 和2015 年对该文件进行了修订［13］，对产品稳定性研究过程中的试验设计、评价过程、研究报告、注意事项等内容进行了指导。该文件适用于试剂、校准品、质控品、稀释液、缓冲液、试剂盒的稳定性评价。

2 影响因素

体外诊断试剂组成成分中包含化学及生物活性物质，保持这些成分物理、化学、生物特性是实现产品稳定性的关键，任何影响产品组成成分特性的因素均有可能对产品稳定性造成影响［14］。

2.1 原材料性能 体外诊断试剂反应过程的实现依赖于各组成成分物理、化学、生物特性的稳定，因此原材料性能的稳定，对产品整体稳定性具有关键作用。体外诊断试剂的原材料成分可能涉及化学物质、抗原、抗体、酶等，而部分原材料的制备可能来源于血液、细胞、细菌、病毒等［15］。生产企业在产品研发阶段应在满足产品检测需求的条件下，筛选性能稳定的原材料，同时，对于特性稳定性不明确的原材料，在研发阶段应对其稳定性进行充分研究。如有些产品其反应体系中含有生物酶，包括胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶等。能够满足反应体系中所需酶活性的酶可能有多种，包括天然的、重组的，天然的还包括动物来源的、微生物来源的等，生产企业在酶的选择中应考虑不同酶的稳定性对产品整体影响；产品反应体系中包含核酸的，应考虑不同核酸分子在储存条件下随时间延长的稳定性，一般而言，相同储存条件下，双链DNA 分子比单链DNA 分子稳定，环状DNA 分子比线性DNA 分子稳定，DNA 分子比RNA分子稳定［16］；反应体系中包含氧化、还原物质的，应考虑随着储存时间的延长，其氧化、还原特性的改变［17］；产品反应体系中包含荧光物质的，应考虑不同类别荧光物质在储存条件下的衰减等。另外，某些原材料在生产前的储存时间对产品稳定性也会造成一定影响，如原材料在生产前储存时间过长，用此原材料生产的产品其稳定性可能受到影响。

2.2 生产工艺 企业在生产过程中，不可避免地要进行主要原材料处理。原材料的处理及生产过程即为生产工艺，包括混合、标记、包被、加热、干燥、冻干等［18］。原材料的处理可能会对其特性造成一定影响，进而影响产品的稳定性，如主要原材料包含蛋白质的，一些加热处理可能会对该原材料的稳定性产生影响；主要原材料包含核酸分子的，反复冻融及超声波处理可能会影响该原材料的稳定性；对于生产过程中需进行荧光素标记的工艺，应注意避光操作，过多的光照可能影响荧光素的稳定性等。另外，生产过程中环境的温湿度条件、细菌状况、原料储存及包装过程均有可能对试剂的性能产生影响，生产企业在生产工艺设计时应考虑稳定性相互影响的不同组分应分开保存，同时对于稳定性差的组分可采用特殊缓冲液保存或以冻干状态保存［19］。

2.3 产品储存条件 一般而言，已上市的体外诊断试剂在用户使用前，应为密闭保存，密闭保存条件对于产品稳定性具有重要作用。一是体外诊断试剂多为液体状态保存，未进行密闭保存的产品随着保存时间的延长可能导致液体蒸发，进而影响产品的反应体系，对产品稳定性产生影响；二是产品未进行密闭保存时，随着保存时间的延长，产品组成成分中某些物质长期接触空气中的一些气体（如氧气、二氧化碳等），会对其性能产生影响，氧气可能会氧化组分中处于还原态的物质，二氧化碳可能影响组分中的氢氧根离子，与之反应生成碳酸根离子等，这些反应均会影响产品稳定性；三是未进行密闭保存的产品，空气中的微生物可能进入产品中，干扰反应体系，如消耗反应体系中的蛋白质、改变反应体系pH 等，进而影响产品的性能［20］。

产品的储存条件是影响产品稳定性的重要因素［21］，包括温度、湿度、光照等。温度会影响产品组成成分中酶的活性，进而影响稳定性。低温可降低酶的活性，包括组成成分中固有的酶类及在产品生产过程中引入的其他与反应体系无关的酶类，从而对蛋白质等主要原材料进行保护［22］。对于保存状态为干片类的产品，如血糖试纸、胶体金试纸及生化反应干片等，湿度也是影响其稳定性的因素，此类产品长期在湿度过高的环境中，过多水分进入反应体系，可能会破坏产品自身储存状态，影响其稳定性。对于反应体系中有荧光物质的产品，光照可能激发组分发射荧光，进而影响荧光物质的稳定性。生产企业在考虑产品稳定性时，还应综合产品预期储存条件。

3 注册资料要求

3.1 基本要求 体外诊断试剂的主要原材料、生产工艺等对产品稳定性均可能产生影响，因此生产企业进行最终稳定性研究所用样品应为在符合产品生产质量管理体系条件下生产的样品，不应为产品实验室研发阶段生产的样品，同时，已进行稳定性研究的产品其原材料、生产工艺等如发生影响产品稳定性的变更，应考虑补充稳定性研究。

生产企业在稳定性研究过程中，应保证除研究对象外其他物品性能能够满足要求，如包含在试剂盒中的样本处理试剂、质控品、校准品、参考品、标准品、临床样本等应在有效期内，且性能满足要求。整体稳定性研究过程中应设置质量控制方法，以保证研究结果的质量。研究者在产品稳定性研究过程中，应明确稳定性研究指标。稳定性指标为最有可能体现储存期间产品的质量、安全性、有效性潜在重要变化的指标。这样的指标可以反映产品本身的物理、生物、化学、微生物特性或使用中产品的分析性能。产品本身的稳定性指标包括颜色、pH、粒径、沉淀物、生物负荷、均一性和纯度；使用中产品分析性能有关的稳定性测试指标包括准确性、精密度、特异性、灵敏度、线性等，对于校准品与质控品，测试指标可为靶值稳定性、均匀性等［23-24］。生产企业应根据自身产品特性选择合适的评价指标，指标的数量和项目取决于具体产品、产品的设计输入要求及类似产品的稳定性经验［25］。

研究者应根据产品稳定性研究时间，设定不同时间点对产品稳定性评价项目进行评价，所选择时间点中应至少包含开始点、中间点及结束点。对于持续时间较长的研究，应明确规则在试验周期内选择多个时间点对产品性能进行评估。对于稳定性研究，研究者应在研究方案中明确产品稳定的可接受标准，此标准可为不同时间点产品性能指标变化的最大许可限度，也可通过评估不同时间点产品性能指标与时间的函数关系，明确回归分析的可接受标准等。研究者应根据研究实际及产品具体情况制定接受标准。

3.2 稳定性研究试验 实时稳定性，也称为货架稳定性，即将体外诊断试剂产品置于生产企业规定条件下进行试剂保存期限的建立或验证。实时稳定性研究可作为设定产品保存条件和有效期的主要依据。试验过程中，研究对象的储存条件应满足生产企业对产品储存要求，如生产企业明确申报产品储存温度为2 ～8 ℃，则研究对象的储存温度应不低于2 ℃或高于8 ℃。实时稳定性应采用多批产品（至少3 批）进行研究，如申报产品适用不同机型，可采用其中代表机型进行研究，研究时间应持续至产品有效期之后。

3.2.1 运输稳定性 运输稳定性是将体外诊断试剂置于运输过程中的极端环境条件下，从而考察产品稳定性的研究，该运输过程应为从生产企业至用户的运输过程。运输稳定性应采用多批产品进行研究，研究过程中，应对产品在运输过程中的储存条件，如温度、湿度等进行实时监测，对运输时间进行规定，产品运输完成后，应对运输后样品进行实时稳定性研究，研究应持续至效期后。

3.2.2 开瓶稳定性及复溶稳定性 一般而言，体外诊断试剂开瓶后应立即使用，对于可多次使用的产品，应对其开瓶稳定性进行研究［26］；冻干产品应对其复溶稳定性进行研究。研究过程中应明确开瓶／复溶后的储存条件，储存条件涉及冻融的，应明确冻融次数要求。

3.2.3 机载稳定性 对使用过程中需装载至适用机型的产品，由于其机载储存条件可能与产品储存条件存在差异，因此应对其机载稳定性进行研究。机载稳定性研究过程中，应明确产品机载稳定性时间，如产品适用不同机型，且不同适用机型试剂仓储存条件不一致时，此项研究应针对不同适用机型进行分别研究。

3.2.4 加速稳定性 加速稳定性是通过设计剧烈环境条件提高化学和（或）物理降解、变化的速度，从而预测体外诊断试剂有效期的研究。常见的加速稳定性研究模型包括基于阿伦尼乌斯方程构建的加速稳定性模型等［27］。加速稳定性研究可用于了解产品在短期偏离保存条件和极端情况下产品的稳定性情况，为有效期和保存条件的确定提供支持性数据［8］。不同体外诊断试剂所含主要组成成分不同，特别是生物活性物质存在差异，因此加速稳定性仅可在产品稳定性研究过程中，预计产品有效期，不能替代产品实时稳定性研究。

另外，针对某些并非每次检测均需校准的体外诊断试剂，生产企业还应考虑校准稳定性及校准频率的研究。

4 相关思考

4.1 合理选择稳定性研究 在开展稳定性研究之前，研究人员有必要结合有关法规要求和技术标准形成合理、清晰的稳定性研究方案。研究方案中需明确此研究的目的、样品批次、测试的项目、测试的间隔时间、具体测试方法及对最终测试结果的分析方法。需强调的是，按照我国体外诊断试剂的法规要求［28］，注册时需提交储存、运输和使用稳定性研究资料，对于加速稳定性研究并不是法规的强制要求，其作用在于预测体外诊断试剂的有效期，而无法作为确定试剂有效期的确定依据，试剂有效期的确定仍需要实时稳定性研究的结果。

4.2 研究与注册的先后时间 稳定性研究试验一般耗时较长，尤其对于实时稳定性研究和使用稳定性研究。生产企业为了节约注册整体时间，将稳定性研究与注册申报并行，希望在注册过程中通过补充资料的形式来提供延长有效期的验证资料，但此过程也意味着生产企业在注册申报时提交的有效期及其验证资料是不充分的。按照医疗器械注册法规要求，注册技术审评过程是基于申请人提出注册申请时的产品作出是否予以注册的技术评价意见，注册过程中提交补充资料的途径并不是改变注册申请内容的过程，应是基于技术审评补正意见的答复，针对的是注册申报时提交的信息范围。因此生产企业应做好充分的注册前研究，笔者不建议通过补充资料的方式变更申请有效期或储存条件。

4.3 稳定性指标的验证方式 国家药品监督管理局重视体外诊断试剂的标准体系建设，目前已发布130 余项体外诊断试剂相关的推荐性行业标准，指导不同试剂产品的生产企业开展研究和注册工作。其中，大多数标准中均有稳定性研究指标，涉及效期稳定性或热稳定性的研究要求。研发企业除了在注册申报时提交稳定性验证资料，还会在编制产品技术要求和进行检验时对稳定性研究指标进行验证。需要注意的是，试剂（盒）产品适用的推荐性标准所涉及的稳定性研究指标有限，生产企业应建立自己的稳定性研究体系，根据实际需要选择合理的稳定性研究方案，明确研究方法的确定依据、具体方法及过程。

5 小结

稳定性研究贯穿于整个产品的研发阶段，其结果是支持产品上市后储存条件及有效期的关键证据。作为产品性能评价的一个重要方面，稳定性研究与产品其他分析性能（如准确性、特异性、灵敏度）不同，不能采用直接测量的研究方法，需将试验样品按规定的储存条件储存，评价产品特性随储存时间的变化情况。产品稳定性研究是生产企业的职责，稳定性研究持续时间长，因此生产企业应在研究开始前，设定合理的研究方案，以期能够为产品储存条件及有效期提供科学合理的证据。在进行稳定性研究之前应按照我国的法规要求并参考国际的相关标准或注册申报指南进行研究设计，以提高研究效率，缩短产品的注册申报周期。