人重组沙眼衣原体疫苗的研究进展

尹晨亮，张庶民 综述，徐颖华，倪现朴 审校

1.沈阳药科大学生命科学与生物制药学院，辽宁 沈阳 110000；2.北京成大天和生物科技有限公司，北京 102600；3.中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京 102629

沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，CT）是一种革兰阴性、专性细胞内寄生的原核细胞型微生物，是引起性传播感染（sexually transmitted infection，STI）的重要病原体，可引发眼部、生殖道等多个系统疾病。2019 年，我国103 个性病监测点统计结果表明，每10万人中，有5.532 万人感染CT［1］。截至2016 年，WHO 统计全球CT 感染者约1.272 亿人［2］，严重影响人类生活健康。根据CT 表面外膜蛋白不同，分为19 种血清型，其中A ～C 血清型引起沙眼；D ～K 血清型主要引起泌尿生殖系统感染，包括男性的非淋菌性尿道炎和附睾炎及女性严重的并发症（如不孕不育、异位妊娠和慢性盆腔疼痛）；L1 ～L3 血清型引起直肠感染［3］。CT 与人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染和传播率的显著增加有关［4］。一项来自印度的研究表明，在不孕症患者中，大部分感染E 型CT，其次是变异体D 和F 型［5］。

目前，对抗CT 感染的主要方法是采用抗生素及对症治疗，但随着抗生素耐药菌株的出现，以及抗生素治疗可能会降低机体对CT 免疫反应的持久性和产生抗体的能力，导致再感染率上升［6］，因此，安全、有效的CT 疫苗可能成为预防和控制CT 感染最有效、最经济的方法，实现对易感人群的长期保护，减少传播并抑制继发性感染。前期，由于CT 自身的免疫逃避机制及独特的双相发育周期使CT 疫苗的研发受到限制［7］。近年，随着生物技术的发展及对CT 免疫保护机制研究的深入，重组CT 疫苗取得了较大进展，重组CT 疫苗CTH522 已获批进入Ⅰ期临床试验，结果表明具有良好的安全耐受性和免疫原性。本文就CT 诱导的细胞和体液免疫反应、相关重组疫苗临床前和临床试验研究进展及面临的挑战作一综述，以期为我国CT 疫苗的开发提供参考。

1 CT 特异性免疫反应

1.1细胞免疫 抗原呈递细胞（antigen presenting cells，APC），如巨噬细胞（macrophages）和树突状细胞（dendritic cells，DC）等，在机体抗CT 感染免疫中发挥重要作用［8］。TLR2、STING 和NLR 等活性分子在DC 内摄取CT 时被激活，并产生促炎细胞因子，如IL-1α、IL-6、IL-12、TNF-α、CCR7 和CXCL10，促使DC 抗原呈递，抗原被摄取后DC 可通过优先产生IL-12，诱导未成熟的CD4+T 淋巴细胞活化和分化为主要的Th1 亚群，刺激机体免疫保护机制，形成针对CT 感染的主要保护［9］。

CD4+和CD8+T 细胞在CT 感染期间聚集至感染部位，表达上调，该结论已在小鼠和非人类灵长类动物模型中证实，激活CD4+和CD8+T 细胞免疫反应是抵抗CT 感染反应所必需的［10］。INFγ 也是对抗CT感染的最关键细胞因子之一，能够激活许多与清除细胞内细菌相关的重要效应途径，如IFNγ 激活吲哚-2，3-双加氧酶（indoleamine-2，3-dioxygenase，IDO），下调细胞的色氨酸水平，抑制CT 的生长；IFNγ 还可诱导一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）上调，生成NO［11］。NO 是一种抗菌因子，可破坏CT 的DNA，具有细胞毒性［12］。另外，IFNγ 抑制转铁蛋白受体分子在宿主细胞表面的表达，导致宿主细胞内铁浓度的下降，影响CT 的生长。

1.2体液免疫 CT 感染能诱导机体产生抗体，包括IgG、IgE 和SIgA 等，且能提供一定的保护作用。但研究发现，这些抗体单独并不能阻止CT 感染及其病情的恶化，可能与再次感染B 细胞介导的免疫反应与初次感染的CD4+T 细胞变化有关［13］。另外，MORRISON 等［14］研究发现，在动物模型体内CD4+T细胞消耗完后，缺乏B 细胞的小鼠也并不能清除继发感染；同样在缺乏B 细胞条件下，机体刺激CD4+T 细胞的能力减弱。因此，在抗CT 感染免疫反应中，B细胞对启动T 细胞免疫反应是必需的，其中抗体可阻断CT 对黏膜上皮细胞的黏附，阻断CT 的进一步感染；抗体介导的调理作用增强巨噬细胞杀伤CT 的活性［15］。

2 重组疫苗候选抗原临床前研究

随着多种组学技术的应用，发现了一些对CT 感染潜在免疫保护的候选抗原，如多态性膜蛋白（polymorphic membrane proteins，Pmps）、蛋白酶样活性因子（chlamydial protease-like activity factor，CPAF）和主要外膜蛋白（major outer membrane protein，MOMP）等，其中基于MOMP 为主要抗原组分的候选疫苗CTH522 已进入Ⅰ期临床试验，而其他候选抗原蛋白还主要集中在临床前研究。

2.1Pmps Pmps 是一组暴露于CT 表面的膜蛋白，通过黏附，在CT 感染的初始阶段发挥重要作用。共发现CT 有9 种Pmps 亚型（A ~ I）［16］，其中PmpG 亚型能够结合其他的抗原蛋白，辅以有效的佐剂可诱导强有力的免疫反应［17］。PmpD 亚型作为一种泛中和抗原，能与不同CT 血清型产生交叉保护［18］。另外，研究证实，Pmps 能通过激活转录因子NF-κB，诱导受感染细胞免疫功能反应，产生IL-8、IL-6 等活性分子［16］。

ROSHAN 等［19］用rVCG-PmpD ／ PorB 重组候选疫苗免疫小鼠，可诱导强烈细胞和体液免疫反应，诱导产生高水平的CT 特异性CD4+T 细胞，分泌IFNγ、TNF-α、IL-2、IL-10、IL-17 及抗PmpD 特异性IgG2c 和IgA 抗体，并保护免疫动物抵抗CT 感染攻击；同时也证实，免疫接种rVCG-PmpD ／ PorB 可诱导保护性免疫记忆反应，即在再次CT 感染攻击后更快地清除病原体感染。另外，研究还发现，小鼠肌内和鼻内免疫rVCG-PmpD ／ PorB 后，两种免疫途径均可诱导CD4+T 细胞分泌相对较高水平的Th1 相关IFNγ 和较低水平的Th2 相关IL-4 细胞因子，诱导刺激CD4+T 细胞增殖［20］。rVCG-PmpD ／ PorB 在体内与Fms 样酪氨酸激酶受体Flt3 ／ Flk2 结合，刺激各种免疫细胞的增殖和分化，产生高滴度抗体。上述研究表明，PmpD 可被抗原呈递细胞识别、降解、加工并呈递给CD4+T 细胞，建议可作为CT 疫苗的候选抗原蛋白。

2.2CPAF CPAF 是CT 分泌的一种丝氨酸蛋白酶［21］，一旦进入宿主细胞胞质，可作为毒力因子，通过降解宿主抗微生物相关多肽物质，助力CT 侵袭感染宿主。另外，研究还发现，CPAF 能够降解宿主转录因子，如USF-1 和RFX-5，同时，促凋亡蛋白BH3也被CPAF 降解，阻断了CT 凋亡［22］。

通过CT 感染患者阳性血清谱分析发现，CPAF具有潜在免疫原性，同时，在动物模型中也证实，CPAF诱导的免疫反应为依赖IFNγ 的细胞免疫，而非产生抗体的体液免疫［23］。MURTHY 等［24］用重组CPAF（rCPAF）经小鼠鼻黏膜接种，可在体内引起强烈的Th1 细胞免疫反应，产生INFγ；当辅以IL-12 作为佐剂时，可显著提高CPAF 诱导免疫应答，并产生黏膜IgA 应答；随后该研究还构建了一种新的CPAF 融合蛋白（rCPAFep），即由5 个CPAF 的T 细胞反应性表位多肽（Cep1-5）融合表达而成，发现具有与全长的CPAF 相同的免疫原性和保护效果，表明这5 个多肽是CPAF 主要的抗原性保护表位，可作为潜在疫苗抗原成分，同时又可避免CPAF 中其他多肽可能引起不良反应的风险。

3 进入临床的重组候选疫苗

MOMP 是一种相对分值质量约40 000 的跨膜蛋白，约占CT 外膜的60%。作为一种优势膜蛋白抗原，MOMP 表面有众多的B 和T 细胞表位，可刺激产生抗体和引发细胞免疫。GUIFENG 等［25］对天然MOMP（nMOMP）和重组MOMP（rMOMP）辅以佐剂CpG-1826 免疫小鼠后，结果发现，rMOMP 在动物模型中仅诱导产生部分免疫保护，而nMOMP 的免疫保护效力更强，表明MOMP 免疫保护性可能高度依赖重组蛋白构象结构。另外，OLSEN 等［26］基于MOMP上可变域VD4 多聚体研发了一种新rMOMP 候选疫苗，VD4 含有B 细胞表位，该候选疫苗能产生中和D、E、F 和G 型CT 的高滴度的抗体，并能诱导较强的T 细胞反应，保护小鼠模型中由CT 感染引起的生殖道病变。

ABRAHAM 等［27］将rMOMP 中所有Cys 残基用Ser 取代，并融合至4 个血清型D ～G 的可变域上，以此MOMP 为基础的CTH522 疫苗进入Ⅰ期临床试验，该疫苗以CAF01 脂质体或氢氧化铝作为佐剂，受试者（19 ～45 岁的健康女性）分别于4 个月内接种3 次结合佐剂的85 μg CTH522 疫苗，随后1 个月内分别接受2 次30 μg 未结合佐剂的疫苗，结果表明，受试者未发现严重不良反应，88% ～93%受试者发生局部不良反应（包括注射部位疼痛、压痛和运动障碍）和全身不良反应（包括头痛、疲劳、不适和肌痛），与目前已批准上市许可的其他重组亚单位疫苗（如乙肝疫苗）的安全性相当［28］。免疫原性分析结果显示，两种结合不同佐剂疫苗在第1 次接种后均产生了免疫反应，第3 次免疫后，CTH522 ∶CAF01 诱导的IgG 滴度比CTH522 ∶Al（OH）3显著提高了5 ～6 倍（P= 0.009 1），且在整个研究周期中其诱导中和抗体和黏膜IgA 水平及介导细胞免疫反应要优于CTH522 ∶Al（OH）3组［27］。表明候选疫苗具有良好的安全耐受性和免疫原性，具有较广阔应用前景。

4 重组CT 疫苗面临的挑战

4.1覆盖CT 血清型广的候选重组抗原选择 重组蛋白疫苗的首要问题是选择广泛覆盖、高度保守、具备强免疫原性的靶抗原成分。尽管目前已发现了许多对不同血清型CT 感染具有一定保护性作用的毒力蛋白，但尚未发现一种具有激发机体针对所有血清型CT 定殖、黏附和侵袭全过程免疫保护效能的蛋白。因此，将不同优势抗原组合，尽量覆盖所有CT 致病性血清型，通过协同激发机体保护性免疫或许是重组CT 疫苗抗原组分最佳选择。近年得到突破性进展、获批上市重组疫苗包括B 群流脑疫苗、幽门螺旋杆菌疫苗等，均包含了多种重组抗原组分。

4.2适宜免疫佐剂的使用 单独的重组疫苗抗原组分通常免疫原性较低，需辅以佐剂增强免疫原性。如乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）和人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV），在相应疫苗配方中加入多种佐剂能够诱导产生较强的免疫反应［29］。HONG 等［30］组合3 种不同佐剂（CpG-ODN1826、AbISco-100 或CAF01）配制了重组PmpG-1、PmpE／F-2和MOMP 疫苗，小鼠动物实验证实，CAF01 作为佐剂可最有效保护BALB ／ c 小鼠免受CT 感染。CAF01是一种阳离子佐剂，由二甲基双十八烷基胺（Dimethyldioctadecylammonium，DDA）和海藻糖二霉菌酸酯的合成类似物（trehaloseD-(+)-trehalose 6，6'-dibehenate，TDB）组成，DDA 具有增强抗原递呈和摄取的能力，确保抗原的持续释放；TDB 作为一种免疫增强剂，保护Th1 和Th17 免疫。DDA 与TDB 的结合能刺激CD4+T 细胞共表达IFNγ 和TNF-α，引起较强的免疫反应［31］。

另外，黏膜免疫能够有效控制CT 的侵入，黏膜佐剂是在感染部位增强免疫的理想选择。目前，最常用的实验黏膜佐剂有基于毒素的佐剂，如LT 等。LT 是强效但有毒的黏膜佐剂，使用定点突变的新一代LT佐剂可减轻毒性。LTK63 是一种突变体，在无酶活性和毒性的情况下保持佐剂活性。ORETTA 等［32］使用LTK63 ／ CpG 佐剂与新发现的T 和B 细胞联合给药，以评估针对CT 疫苗效力，结果表明，LTK ／ CpG 疫苗佐剂产生较强的Th1 免疫反应，其特征是诱导由TNF-α 或IL-2 共同表达的抗原特异性IFNγ。

4.3有效疫苗评价的动物模型 适宜的动物模型对CT 感染的研究及候选疫苗的开发和评估是必不可少的，目前常用的动物模型包括小鼠、豚鼠、非人灵长类动物等［33］。小鼠是研究生殖器CT 感染和评估候选疫苗最广泛使用的动物，具有体积小、易于处理、丰富的免疫抗原等优势，目前已报道的有C.trachomatis和C.muridarum两种小鼠模型。豚鼠模型在CT 感染后的病理、生殖激素对感染的影响及感染的性传播途径更接近于人类感染CT 病理变化。豚鼠对再感染的免疫力持续时间较短，与人类相似，适用于评估潜在的候选疫苗［34］。

由于人类和非人灵长类动物之间具有密切的进化关系，基因相似度高，因此，使用灵长类动物研究由CT 引起的生殖道疾病最具有可比性。其中研究最多的是猕猴，猪尾猕猴的雌性生殖道的解剖结构和生理特性与人类相似，在自然界也易受人类CT变种的生殖道感染，不需进行预处理［35-36］。另外，VANROMPAY 等［37］将猪作为研究CT 生殖道感染的大型动物模型进行评估，发现雌性猪生殖组织中表达的大多数基因均在人类生殖器组织中普遍表达，且猪自然易感CT。猪动物模型也用于CT DNA 疫苗的评价研究，结果表明，接种该DNA 疫苗可诱导产生对CT 攻击的免疫保护［37］。但猪模型不适合需要大量动物的基础研究，是否能作为有效动物模型还有待进一步研究。

5 小结与展望

CT 感染是全球公共卫生问题之一，其独特又复杂的双相发育机制，使其在感染初始阶段可通过黏膜中和抗体进行有效控制［38-39］，包括IgA 和IgG 抗体均可在初始阶段阻断CT 的细胞附着；CT 被内化后，分泌Th1 的干扰素IFNγ 细胞在机体抗感染免疫反应发挥重要作用［40］。因此候选疫苗需要能同时激发Th1 和Th2 免疫反应，可能产生更好的保护效果。基于当前的研究成果，单个CT 抗原蛋白的免疫作用偏弱，且CT 有多种血清型分类，需要多种保护性蛋白组分的共同作用，通过协同激发机体保护性免疫或许是重组CT 疫苗抗原组分的最佳选择。

新型强有力的佐剂和递送系统在重组疫苗研发中也是非常重要的，能够克服重组蛋白质折叠的问题［41］。虽然黏膜佐剂是CT 疫苗开发的一个新突破，但其制备复杂，其向人类生殖器黏膜的递送存在问题，需要进一步的改进和完善。另外，应需要选择除小鼠以外的动物模型进行候选疫苗评价研究，如猕猴和豚鼠等动物模型评估有效的疫苗配方。通过在合适的动物模型中优化疫苗配方、佐剂和递送系统，并产生合适的候选CT 疫苗，用于后续临床试验。随着疫苗研制技术的不断进步，对感染宿主细胞机制的了解及候选抗原的筛选，有望研制出高效的重组CT 疫苗。