大气气溶胶微生物群落的分子生物学检测和监测方法的研究进展

周小军，付莹莹 综述，王红昌，贾锐 审校

中国生物技术股份有限公司生物安全管理部，北京 100025

微生物在环境中无处不在，并且在生态系统中发挥重要功能［1］。气溶胶是指固体或液体小质点分散并悬浮在气体介质中形成的胶体分散体系，生物气溶胶是指含有生物性粒子的气溶胶，主要包括细菌、真菌、病毒、致敏花粉、霉菌孢子、蕨类孢子、寄生虫卵以及很多抗原化合物、微生物毒素等［2］。据估计，大气中初级气溶胶有16% ～80%来自生物性粒子。室内或室外环境下对生物气溶胶的暴露被认为与一系列有害健康的影响有关，如呼吸系统疾病、过敏和癌症等［3-4］。

生物气溶胶组分大小各异，通常情况下，植物花粉直径在17 ～58 μm 之间，真菌孢子直径在1 ～30 μm 之间，细菌直径在0.25 ～8 μm 之间，病毒直径一般小于0.3 μm。生物性粒子有时会形成复合体，研究显示，内陆区域大部分细菌会与直径大于3 μm的粒子结合，如空气传播的植物或动物组分、土壤颗粒、孢子等［5］。空气传播细菌和真菌能分别达到103和105个／ m3，气溶胶化的细菌和真菌能达到10 ～20 km 高度的对流层，甚至能达到海上20 ～40 km高度的平流层［6］。

越来越多的证据表明，生物气溶胶通过影响大气的物理和化学过程进而影响大气环境［7］，大气中微生物群落结构随时间的改变与大气的物理、化学特征显著相关［8］。但关于大气中生物气溶胶组分及其变化与地理或气象条件的关系却知之甚少。对于现场条件下空气传播微生物物种的准确评估很困难，影响因素包括采样器的收集效率、不同微生物物种的活力差异、同一物种不同株的区分等。本文对生物气溶胶对公众健康的影响、不同采样方法以及微生物物种鉴定的分析方法等作一综述。

1 生物气溶胶对人体健康的有害影响

生物气溶胶由致病性或非致病性细菌、真菌、病毒、高分子量过敏原、细菌内毒素、霉菌毒素、肽聚糖、β（1→3）聚糖、花粉、植物纤维等成分组成［3］，其对于人体健康影响最明确的是呼吸系统。植物花粉、真菌孢子、细菌内毒素等均与哮喘症状的发生有关［3，9-10］。通常作为水质指示物的大肠埃希菌被发现存在于室内和室外空气粉尘中［11］，表明某些经粪口途径传播的潜在致病性微生物还可通过空气传播或食物污染等方式威胁公众健康，目前尚未发现吸入含此类病原体的粉尘会导致人体呼吸系统疾病发生［12］。

风飏粉尘是生物气溶胶领域研究较多的一种，其起源于世界各地干旱地区，如沙哈拉沙漠、中东亚、中东地区等，且对人体健康和下风向环境均有影响［12-13］。研究表明，风飏粉尘含有一些条件致病菌，如Aspergillus fumigatus、Aspergillus niger、Staphylococcus gallinarum、Gordonia terrae［14］，但尚无报道发现风飏粉尘的长距离转运与人体感染性疾病有关。

尽管生物气溶胶暴露对人体健康的有害影响正引起越来越多的关注，但造成这些影响的特定组分却不明确。由于不同种微生物在潜在致病性上差异显著，对生物气溶胶过敏原和病原体的鉴定需达到种甚至是株的水平。此外，有关生物气溶胶引起疾病症状的发生、进展的主要机制和作用的研究仍不够深入［15-16］。尽管世界卫生组织（WHO）以及美国国家环境保护局（US EPA）发布的指南提供了能用于微生物危险鉴定的方法，但目前关于微生物及其有害影响的剂量效应的研究和相关阈值的认知仍不足［17］，主要原因是缺少准确、可定量、综合的暴露评估方法以检测生物气溶胶中微生物病原体。病原体检测技术上的进展较多使用的是分子生物学方法［18-19］。

2 生物气溶胶的检测和监测

2.1采样方法

生物气溶胶研究目前主要聚焦于对周围或目标生物气溶胶的监测和控制，对生物气溶胶的有效监测需对空气中微生物物种进行有效采集。已建立了一系列生物气溶胶采样方法，同时已开发许多颗粒采样设备［2，17］。不同设备有各自的优缺点，多数情况下研究目的决定了合适采样方法的选择［6］。对数据分析而言，采样地点的准确选取也至关重要。3种主要的采样方法（过滤式、固体撞击式、液体撞击式）用于生物气溶胶采集。

2.1.1过滤式 是大气生物气溶胶采样中应用最广泛的方法之一，其原理为将空气泵入多孔的滤膜以捕获生物性粒子，其优点在于广泛适用性、高效捕获效率、低成本性、高便携性等。滤膜材料包括纤维素膜、尼龙膜、聚碳酸酯膜、玻璃纤维，常用孔径为0.02 μm。过滤采样气流速率通常在300 ～1 000 L ／ min［2，14］，不同孔径不同材料的滤膜对于直径低至0.035 μm的粒子采集效率通常大于95%［20］。过滤法可用于细菌、真菌、花粉、病毒等采集，通过膜过滤法采集的生物性粒子活性不受影响，甚至能吸收空气中水分和养分而生长，环境压力改变引起的反向气流可能导致膜上收集的生物性粒子重悬到空气中。能形成孢子的微生物在过滤法收集后更易于被回收。为了能解决以上问题和沉积生物气溶胶，开展新过滤材料研究十分必要。

2.1.2固体撞击式 是通过气泵在含营养琼脂培养皿（也可是盒状或条状）捕获生物气溶胶粒子，通过窄缝或孔洞控制上方气流分布均匀，同时能控制不同大小粒子的运动方向。该方法采集气流速度在10 ～700 L ／ min［14］。孢子陷阱、玻璃平板级联采集器、MOUDI 采集器等均成功应用于真菌和细菌采集及后续PCR 反应等［21-22］。该方法的优点为简便易携带、成本低以及可评估单位体积空气中可培养的细菌和真菌数量；缺点为低气流速率导致采样体积小、撞击导致活性降低、因未能吸附于琼脂表面而导致微生物物种回收效率下降［14］。

2.1.3液体撞击式 生物气溶胶也可通过液体撞击式采样器得到收集，以常用的AGI-30 液体式采样器为例，可实现低流速有效采集。该方法的优点为成本不高，采样的样本可用于培养或直接计数、分子实验等非培养多种分析用途［14］；缺点为玻璃容器易碎、采集速率低、成本高、因挥发或剧烈产生气泡而损失、对病毒大小粒子的捕获效率低、活性损失等［23］。

2.2空气传播微生物物种的培养鉴定法 传统的空气生物学研究聚焦于细菌的采集以及通过计数和培养的方法对样本进行分析，传统培养方法一般通过标准方法（如国际标准化组织ISO 提供的方法）来建立并用于微生物物种的分析和微生物危害评估，主要通过选择性液体或固体培养基来分离和扩增目标微生物，同时阻止其他微生物的生长。

传统培养法的局限在于总体计数耗费时间、人力，对微生物物种的鉴定也存在问题，如在特定时间和实验条件下，一些具有潜在健康危害的微生物物种无法实现培养，研究表明，大部分微生物被认为具有活性，但不在琼脂平板上形成菌落［2］。另外，具有毒性或过敏原性的细菌碎片、死亡微生物以及其他微生物组分也无法被检测［3，14，24］。

2.3 空气传播微生物物种的非培养依赖鉴定法 非培养依赖法已应用于空气微生物学研究的诸多领域［25-28］，在微生物多样性评估方面可提高细菌鉴定的特异性和环境研究的敏感性，与传统培养法相比具有一定的优势［29］。分子生物学方法的高灵敏性和特异性以及快速的特点使其在环境质量和空气病原微生物监测中得到应用［30-31］。

PCR 是微生物物种检测的一种标准方法，通过特定引物和热稳定的DNA 聚合酶实现对目标DNA区域的对数级扩增［32］，由于是对目标DNA 而非信号的扩增，更不易产生假阳性。PCR 法为雾霾成分PM10 和PM2.5 中有机成分的描述、公共卫生研究中感染性和过敏性物质的追踪以及大气微生物生态学研究提供了具体的生物量信息［2］。

其他分子生物学工具，如变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、末端限制性片段长度多态性（terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）等，也越来越多地用于生物气溶胶PCR 的后续分析［33-35］。生物化学方法，如酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、鲎变形细胞溶解物（limulus amebocyte lysate，LAL）试验也应用于生物气溶胶研究［36］。为了克服传统培养法的局限，Sanger 测序法、DGGE、T-RFLP 被用于大多数生物气溶胶研究中微生物群落多样性的评估［37-38］。但这些方法对于详细研究微生物群落结构的能力仍不足，Sanger 测序法在大基因片段的直接测序上存在时间长、成本高等问题；T-RFLP 由于数据库中报道的16S rRNA 基因序列有限，可能误判为新序列或容易返回许多未知序列，其对于微生物多样性的评估会受测序位置的影响等［39］；DGGE 对于稀有细菌多样性的评估能力不足，适用性宽泛引物用于细菌分类鉴定时往往会丢失稀有细菌组别［40］。

由于微生物丰度和活性会影响公众健康和下风向生态系统，荧光原位杂交（fluorescence in-situ hybridization，FISH）和流式细胞术（flow cytometry，FCM）也被用于生物气溶胶样本活性分析［41-42］。FISH能同时检测可培养和不可培养微生物物种，有助于了解环境中的实际微生物污染情况。由于可同时进行微生物可视化、鉴定、计数以及定位等，FISH 在微生物学各领域均有很多应用［43］。将荧光技术与FCM 结合应用可区分生物和非生物物质，也可区分微生物不同生理状态。尽管荧光染料和FCM 被广泛用于水生环境中原核和真核微生物的总浓度及活性评估，但该技术尚未大规模应用于生物气溶胶的评价研究［44］。

2.4 实时定量PCR（real-timequantitativePCR，qPCR）技术 qPCR 技术广泛应用于微生物生态学中不同环境样本的分类学和功能基因标记物的丰度定量［45］，通过在PCR 反应过程中对荧光标记的扩增产物的连续实时监测，可对目标DNA 进行准确定量［46］。与PCR 法相比，qPCR 具有结果获取更快、变异度更小、灵敏度更高、可定量等优点。由于技术上的迅速进步，qPCR 目前已成为水源性或食物源性细菌、病毒等病原体鉴定的标准方法之一［46］。双标记荧光探针，如TaqMan 探针，因其更高的特异性，在环境样本病原体检测中最受欢迎。同时，内参基因和探针的使用可对核酸提取、逆转录过程（对RNA样本而言）以及是否存在PCR 抑制剂等情况进行监测。除TaqMan 探针法外，另一种可选的qPCR 方法是SYBR green 荧光法，SYBR green 荧光染料在与双链DNA 结合时，会有更高的发光强度。使用SYBR green 荧光法时，引物的恰当选择以及引物浓度的优化对于目的基因的有效扩增，避免非特异性产物是必要的［45］。

2.5 微阵列技术 微阵列技术可用于多核酸分子的平行、高通量检测，在适合的探针库可用情况下，微阵列技术可在单次实验中同时完成大量微生物株、种、属或更高层级水平的检测与鉴定［47］。其优点为将核酸扩增策略与分子杂交、微阵列大样本筛选能力相结合，从而实现高特异性、高灵敏度以及高通量检测。通过对保守区域设计高特异性和高灵敏度的探针，可用于大量环境样本的检测。尽管微阵列技术已成功应用于许多环境研究中基因表达分析，但该技术的应用仍存在许多障碍，如探针的合理设计、探针的周期性更新、目标序列的覆盖度、实验的特异性与灵敏性等［48-50］。

由于基因数据库（GenBank）的快速发展，高密度的系统发生或功能分析微阵列可同时用于复杂环境样本中微生物群落分析［51］。新微阵列技术的应用，如PhyloChip 和GeoChip，也应用于微生物群落结构和功能基因分析。PhyloChip 以16S rRNA 基因内已知多态性为靶标，可同时分析成千分类单元中的任何一个，其现行版本可同时检测多达50 000 个细菌、古生菌和微藻分类单元的检测。GeoChip 包含28 000 个探针，能覆盖约57 000 个目标基因及其变异体的分析［52］。PhyloChip 和GeoChip 均成功应用于环境生物修复过程中细菌种群的监测、病原微生物检测以及特殊环境样本的微生物溯源分析等［53-54］。

2.6高通量测序技术（454 pyrosequencing and Illumina MiSeq，HiSeq） 在过去几十年间，Sanger 测序在包括临床、环境、食品、工业等领域被广泛应用，尽管技术上取得了一些进展，但许多方面仍存在局限［55］。下一代测序技术（next-generation sequencing，NGS）的快速发展，如以454 焦磷酸测序、Illumina MiSeq 和HiSeq 测序为代表的测序系统的出现，大大提升了PCR 扩增子读取容量［56-58］。目前商业化应用广泛的下一代DNA 测序系统主要包括罗氏公司的Roche’s（454）GS FLX Genome Analyzer 和Illumina 公司的MiSeq 和HiSeq 测序系统。

作为第一个高通量大规模平行测序平台，454焦磷酸测序对象为与微珠（micro bead）吸附的、采用乳糜化（emulsion）PCR 反应扩增的DNA 文库片段。GS FLX Titanium 平台可完成百万个包裹着DNA 克隆片段微珠的平行测序。该系统的持续改进使单个读取序列的测序长度增加至400 ～800 个碱基，单次运行可产生1 Gb 的数据信息（表1），读取长度的增加使得对细菌群体结构的解读达到更高分辨率水平［59］。环境样本中的次要细菌种群也能被检测到［60］，而且测序过程中不发生抑制性物质的积聚。研究表明，454 焦磷酸测序可依据16S rRNA扩增子序列信息确定空气传播细菌种群大小、多样性以及潜在致病性等，更利于明确个体序列的系统分类［61-63］。此外，由于454 焦磷酸测序可提供最长的读取序列长度，可能尤其适合基因组从头组装。其缺点为同聚重复序列测序的准确性，插入序列是最常见的错误类型。

表1 不同的下一代测序平台信息比较Tab.1 Comparison of different NGS platforms

Solexa ／ Illumina Genome Analyzer 广泛应用于许多环境学研究［64-66］，该平台同样能实现百万数量碱基的平行高通量测序，与454 焦磷酸测序系统使用磁珠不同，克隆DNA 簇是通过在玻璃表面的桥式扩增形成的。Solexa ／ Illumina 测序技术所使用的可逆转终止化学反应克服了同源聚合重复序列中的碱基数量不确定性问题。与454 焦磷酸测序系统相比，Solexa ／ Illumina 平台的测序成本低10%，而产出更高［65］。MiSeq 平台在成本相对较低的情况下可提供2 × 250 碱基长度、最高8.5 Gb 测序数据产出，而HiSeq 平台则能提供2 × 150 碱基长度、最高200 Gb 测序数据产出。HiSeq 平台已成为全基因组鸟枪法（whole-genome shotgun sequencing）测序的标准方法。由于读取长度更长、分辨率更高、经济性更好等优点，MiSeq 平台在16S rRNA 测序研究中的应用潜力更大。

2.7宏基因组学方法（16S rRNA 扩增子测序法和全基因组鸟枪测序法） 以NGS 测序为基础的宏基因组学方法（如16S rRNA 扩增子测序法和全基因组鸟枪测序法）是深入挖掘环境中混合微生物群落信息的合适方法［67］，其研究对象是自然环境下直接采集的非培养样本。该方法可用于微生物多样性及构成的分类学和功能学研究，以及微生物种群与人类健康有关环境因素时空改变相关性研究。宏基因组学方法是研究复杂微生物群落特性（尤其是生物气溶胶中微生物总体威胁）的重要工具，而且随着NGS 技术的应用取得了长足进步。由于现有方法所限，环境中99%的微生物无法进行培养，宏基因组技术可为微生物群落结构、系统构成、物种多样性、代谢特性、功能多样性等方面研究提供新的可能性。

自20 世纪90 年代中期开始，16S rRNA 测序作为所有宏基因组项目的第一步，广泛应用于复杂环境样本中微生物多样性鉴定［68-69］。NGS 测序技术靶向16S rRNA 高变区（V1-V9），尽管最佳区域仍存在争议，但测序错误概率最小的高变区分别是V4-V5（454 焦磷酸测序）和V4（Illumina MiSeq）。随着16S rRNA 数据库的快速发展，如SILVA、GreenGenes、RDP（Ribosomal Database Project）等，诸多环境样本中微生物多样性及组成结构信息可在更高分辨率下更快、更容易地被获取［70-71］。另外，16S rRNA 测序技术可用作病原菌分类的初步筛选，以快速鉴定未培养的微生物、不寻常分离株以及环境或临床背景下特定表型的分离株的鉴定等［72-73］。16S rRNA 测序技术也存在如分类学上的分辨率和种水平上的进化和功能机制研究能力等方面的局限，同时，其分析会受诸多因素影响，如PCR 扩增引入的嵌合序列、引物或标签错配引起的测序错误。

全基因组鸟枪测序法是用于微生物群落多样性及构成分析的另一种方法，其研究对象是环境样本中获取的随机DNA 片段，首先破碎成小片段后进行测序，再应用许多软件（如SOAPdenovo、Velvet、CLC assembly、ALLPATHs-LG）进行拼接，在完成空白填充后组成完整基因组序列。相比于16S rRNA 扩增子测序法，该方法在研究一些多细胞微生物以及其进化相关环境背景时能更加深入［74］。全基因组鸟枪测序法近年来已广泛应用于包括人类宏基因组、污水环境、土壤宏基因组、雾霾环境、抗生素抗性基因相关微生物群落的分析［75-77］。尽管全基因组鸟枪测序法不受测序偏向和固有错误率等影响，但对于整个微生物群落相对丰度的宏基因组数据随着DNA提取和所用测序工具不同而差异较大。另外，全基因组鸟枪测序法需要相对复杂的分析过程，如高分辨率组装、数据筛选、注释等。由于缺少参比数据库，宏基因组测序数据的准确性评价也需充分考虑。

3 结语和展望

关于生物气溶胶中微生物群落结构的研究可采用许多不同的方法，这些方法的应用范围和解决不同问题的能力各有特点。对生物气溶胶释放以及其中病原微生物引发疾病的担忧，促使可用于病原体检测的分子生物学方法在技术上取得了长足进步。选择何种分析方法，取决于所需信息是否定量和特异以及范围是否宽泛等。相关技术方法的联合应用使含有细菌、真菌和病毒复杂多变的大气背景条件下对特定目标微生物的检测更易实现，同时也将增进对于气溶胶化的微生物群落结构、存活和转运特性的认知。生物气溶胶相关研究仍处于起步阶段，许多问题的阐明有待对技术的持续开发和研究成果的创新应用。