基于聚合物分析系统流感疫苗裂解效果检测方法的建立及验证

郭晶晶，宋晓红，刘华擎，陈秋兰，张颖，王洁如

1.北京科兴生物制品有限公司，北京 100085；2.岛津企业管理（中国）有限公司，北京 100020

流感病毒裂解疫苗是用WHO 推荐并经国家药品管理部门批准的流感病毒株接种鸡胚，通过培养、收获，灭活、纯化、裂解等步骤制成的生物制品，广泛应用于预防流感病毒引起的流行性感冒。流感病毒属正黏病毒科，单股负链RNA 病毒，由核衣壳和包膜组成［1-2］。包膜上嵌有血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA），可刺激机体产生中和抗体和抑制病毒在体内扩散的保护性抗体［3-5］。病毒中的类脂和内部蛋白等成分易引发不良反应［6］。流感病毒裂解疫苗生产过程中，常使用去氧胆酸钠、TritonX100、TritenN101、乙醚和聚山梨酯80 等裂解剂，病毒的裂解程度（已裂解病毒占病毒总量的百分数）直接影响疫苗的免疫原性和安全性［6-9］。目前，通用的裂解效果评价方法是电镜观察法［10］，虽具有可直接观察病毒颗粒微观结构和高分辨率的优点，但也存在取样量小和视野选择受限等问题，导致裂解程度无法定量，结果不准确。

聚合物分析系统（Aggregates Sizer）是一种高稳定、高灵敏和自动化程度高的分析工具，该系统是以半导体激光为光源，依据光的散射与衍射现象建立数学模型，散射与衍射的光能角度只与颗粒粒径有关［11］。当检测对象为颗粒群时，不同粒径颗粒的数量决定了对应各特定角获得的光能量，各特定角光能量在总光能量中所占比例可反映各颗粒的分布丰度。Aggregates Sizer 可检测7 nm ～800 μm 范围粒子的粒径，且可定量检测40 nm ～20 μm 范围内生物制药颗粒物的浓度，并可检测颗粒物的形成过程及浓度变化［12］。通过建立病毒颗粒分布丰度-裂解程度标准曲线方程，评价流感病毒的裂解效果。因此，本研究旨在基于Aggre-gates Sizer 系统建立一种初步评价病毒裂解程度的新方法，从而提高流感疫苗病毒裂解程度数据的可靠性。

1 材料与方法

1.1标准品 流感病毒裂解疫苗原液A（由裂解液制得，病毒颗粒已裂解）和B（由裂解前纯化液制得，病毒颗粒未裂解）均由北京科兴生物制品有限公司提供。

1.2主要仪器 Aggregates Sizer 系统［含高浓度池测定装置SALD-HC75S，样品量0.125 mL，采集软件WingSALD bio-7500 for English（US）V3.3］购自厂家岛津企业管理（中国）有限公司北京分公司。

1.3裂解效果评价用样本的制备 分别取流感病毒裂解疫苗原液A 0.6、0.7、0.8、0.9 和1.0 mL 于离心管中，依次加入0.4、0.3、0.2、0.1 及0 mL 的原液B，配制成裂解程度分别为60%、70%、80%、90%和100%的系列工作液。另取60%、80%和100%裂解程度的工作液作为质量控制（quality control，QC）样本。

1.4分析方法 用Aggregates Sizer 系统检测待测物颗粒粒径、浓度和分布，光源发出的光照射到样品上产生散射衍射光和散射光，WingSALD bio-7500 for English（US）V3.3 软件采集散射衍射光光强数据，并根据光强数据换算得出颗粒粒径大小和分布数据，根据WingSALD bio-7500 for English（US）V3.3 内置曲线，计算出不同粒径颗粒的分布丰度。

1.5病毒颗粒粒径检测 将原液B 稀释4 倍，加入至Aggregates Sizer 系统的样品池中，按1.4 项方法进行检测，得到各粒径的分布丰度。

1.6标准曲线建立 取裂解程度为60%、70%、80%、90%和100%的系列工作液，分别加入Aggregates Sizer 系统样品池中，按1.4 项方法测定，以病毒颗粒累积分布丰度为纵坐标，裂解程度为横坐标，进行线性回归，建立回归方程，计算相关系数（r2）。

1.7方法的验证 取不同裂解程度的QC 样本进行检测分析，以当日的标准工作曲线计算QC 样本的裂解程度，重复3 次，准确性以相对误差（relative error，RE）表示，精密性以相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）表示。

1.8数据分析 所有实验数据均采用Excel 软件进行统计分析。

2 结 果

2.1病毒颗粒粒径 在0.04 ～20 μm 粒径检测范围内，原液B 中主要分布0.04 ～0.3 μm 粒径的颗粒，且以约100 nm 粒径的颗粒居多，见图1。

图1 不同粒径粒子的分布丰度Fig.1 Distribution abundance of particles at different sizes

2.2标准曲线建立 60%、70%、80%、90%和100%裂解程度工作液在0.04 ～20 μm 粒径检测范围内，不同粒径颗粒的分布丰度和累积分布丰度逐渐降低，见图2。不同裂解程度系列工作液的标准曲线见图3，工作液在60% ～100%裂解程度范围内与病毒颗粒累积分布丰度呈良好线性关系，标准曲线方程为y= -2 600x+ 2 610，r2为0.995。

图2 不同裂解程度工作液检测图Fig.2 Determination images of working solutions at different lysis degrees

图3 不同裂解程度系列工作液的标准曲线Fig.3 Standard curve for working solutions at different lysis degrees

2.3方法的验证 不同裂解程度QC 样本经3 次检测的RE均＜2%，RSD均＜0.05%，见图4 和表1。表明该方法具有良好的准确性和精密性。

表1 方法准确性及精密性验证结果Tab.1 Verification for accuracy and precision of developed method

图4 QC 样本检测图Fig.4 Determination images of QC samples

3 讨 论

本研究采用Aggregates Sizer 系统建立了流感疫苗裂解效果的检测方法，并初步对该方法进行了验证。检测结果表明，流感病毒颗粒主要分布在0.04 ～0.3 μm 范围内，且较集中分布于约100 nm；工作液在60% ～100%裂解程度范围内与病毒颗粒累积分布丰度呈良好线性关系，标准曲线方程为y=-2 600x+2 610，r2为0.995；该方法准确性验证RE均＜2%，精密性验证RSD均＜0.05%，表明准确度和精密度较高，符合生物样品分析方法指导原则的要求［13］，可用于病毒裂解疫苗的裂解效果评价。

有文献报道，流感病毒通常为球形颗粒，粒径为80 ～120 nm，本文结果与报道相符［14］。研究发现，存在少量的丝状结构病毒颗粒，可能是由于在0.3 ～0.8 μm 间出现响应值的原因，但总体所占比重较少。提示在后续的方法开发中应主要对0.04 ～0.3 μm 粒径颗粒进行统计分析，并从颗粒结构和团聚等多个角度探究0.3 ～0.8 μm 间出现响应值原因，以作出相应改进措施。研究过程中，对50%及小于50%裂解程度工作液进行检测，出现多重散射，信号偏移，造成检测结果不准确，因此该标准曲线裂解程度的检测下限为60%（未在正文表述）。

本研究建立了一种基于Aggregates Sizer 系统分析病毒裂解程度的方法，检测方便快捷，受限少，并可监测整个生产过程中病毒颗粒的粒径分布及浓度改变，为疫苗行业中裂解疫苗的病毒裂解效果评价提供一个研究方向。该方法仍处于初步开发中，存在许多不足。如尚未对基质效应进行考察，即经培养和纯化工序得到的空白基质液，是否会对病毒颗粒粒径的检测产生干扰尚未明确。根据《中国药典》三部（2020 版）规定，采用柱色谱法或蔗糖密度梯度离心法及其他适宜方法进行纯化得到的疫苗原液中总蛋白含量不高于血凝素含量的4.5 倍［15］，严格控制除有效成分血凝素外其他杂蛋白的含量，激光粒度仪检测颗粒浓度的最低粒径为0.04 μm，推测空白基质可能不会对病毒粒径检测产生干扰。因此，后续仍需对该方法进行深入研究。