人脐带间充质干细胞对异体人外周血单个核细胞的免疫调节作用

陈耐寒，赵仁彬，孙鷖，李丽，郑永钦，左荣霞，张进萍，赵倩，沈涛，撒亚莲

1.昆明理工大学附属医院云南省第一人民医院临床医学研究中心 云南省出生缺陷与遗传病研究重点实验室云南省临床病毒学重点实验室，云南昆明 650032；2.云南省第一人民医院国家临床重点专科血液科，云南 昆明 650032；3.云南省第一人民医院检验科，云南 昆明 650032

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是来源于中胚层的一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，免疫原性低，具有独特的免疫调节特性［1-2］。近年来相继从骨髓、脂肪、皮肤、外周血、牙髓、肌腱，以及新生儿附属组织，如脐带、胎盘、羊膜等组织中获取MSCs，其中人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）因来源充足，取材方便，且无明显的伦理学争议等优点，成为临床细胞治疗研究的一个热点［1-3］。

已有研究表明，MSCs 具有支持造血和免疫重建，以及在组织损伤修复与再生、自身免疫性疾病中有一定的治疗作用［4］。目前在Clinicaltrials.gov 注册的临床试验针对的适应症主包括移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）、膝骨关节炎、炎症性肠病、狼疮性肾炎、银屑病、早发性卵巢功能不全、烧伤、脊髓损伤、心肌梗塞以及肝硬化等疾病［5-6］。古利明等［7］观察到hUC-MSCs 联合抗病毒等方法在控制新型冠状病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）重症患者的炎症反应和组织损伤中安全有效。然而，MSCs 的临床疗效与适应症、治疗方案、不同研究者使用的MSCs 质量等密切相关，其中，MSCs 的质量属性是比较分析不同研究者研究结果的基本要素。免疫调控能力是评价MSCs 生物学有效性最为相关的重要质量属性之一［8-9］，通过检测MSCs 释放免疫调控分子、抑制促炎性免疫细胞增殖或活性、促进调节性免疫细胞增殖或极化的功能，以及MSCs 自身分泌不同类型免疫调控因子的能力等进行评价。本研究通过检测hUC-MSCs 对异体人PBMCs 增殖能力及其CD4+CD25+CD127dim／-调节性T 细胞（regulatory T cells，Treg）亚群分化能力的影响，探讨hUC-hMSCs 的免疫调节特性，为建立MSCs制剂质量评价技术体系和提高实验室检测技术能力奠定基础。

1 材料与方法

1.1细胞及外周血 原代hUC-hMSCs 来自健康足月剖腹产产妇提供的新生儿脐带，孕妇均签署知情同意书。提供；健康体检人群外周血由昆明理工大学附属医院提供。本研究获得昆明理工大学附属医院伦理委员会批准，样本捐献者均签署知情同意书。

1.2主要试剂及仪器 淋巴细胞分离液（LSM-200）购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；植物血凝素（phytohaemagglutinin，PHA）（20200108）购自广州达晖生物技术服务有限公司；胎牛血清（1932595）购自美国Gibco 公司；低糖DMEM 培养基（AD17218269）、RPMI1640 培养基（0024318）购自美国Hyclone 公司；DPBS（0034819）、MSCs Nutri-Stem XF Medium（2008115）购自以色列BI 公司；鼠抗人单克隆抗体CD3（Z6410001）、CD4（Z6410005）、CD25（Z6410045-100T）、CD127（Z6410052-100T）购自北京同生时代生物技术有限公司；hUC-MSCs 成骨（CHEM-200008）、成脂诱导分化试剂盒（CHEM-200007）购自上海麒盟生物医药有限公司；hUCMSCs成软骨诱导分化试剂盒（HUXUC-90041）购自广州赛业生物科技有限公司；Countstar 自动细胞计数仪购自武汉科尔达医疗科技有限公司；全自动血液细胞分析仪BC-5100 购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；流式细胞仪购自安捷伦科技有限公司。

1.3hUC-MSCs 的分离、培养及成脂、成骨、成软骨样细胞分化潜能的鉴定 参考文献［10］。采用组织块贴壁法培养原代hUC-MSCs，经酶消化法传代培养扩增细胞，获得第4 代hUC-MSCs，按每孔3 × 105个接种6 孔板，待细胞达80%融合时进行成脂诱导分化，待细胞达60%融合时进行成骨诱导分化，具体操作按照试剂盒说明书进行，定期更换诱导培养液，显微镜下观察细胞形态变化。成软骨诱导分化：将3 ×105个细胞转移至15 mL 离心管，250×g离心4 min，弃上清，预混液洗涤2 次，加入诱导完全培养基重悬细胞团，150 ×g离心5 min，不弃上清，直接将离心管置37 ℃培养箱静置培养24 ～48 h；当细胞团聚拢成小球时，轻弹离心管底部，使小球悬浮在液体中，随后每隔2 ～3 d 更换诱导完全培养液，其间观察诱导液和小球变化。待成脂、成骨、成软骨持续诱导培养23 d 后终止诱导，弃上清，PBS 洗涤2 次，4%多聚甲醛固定，成脂、成骨样细胞固定20 min 后，油红O 染色鉴定是否为脂肪样细胞，茜素红染色鉴定是否有成骨细胞产生的钙盐沉积；离心管底的软骨球固定1 h 后，进行脱水、石蜡包埋切片、阿利新蓝染色，确定是否有软骨细胞特征性成分酸性黏多糖存在。

1.4人PBMCs 的分离 采用Ficoll 密度梯度离心法。向EDTA 抗凝管里添加等量PBS，充分混匀，缓慢加至淋巴细胞分离液面上，500 ×g离心20 min；取乳白色中间层细胞悬液至新的离心管中，PBS 洗涤细胞，300 ×g离心5 min；弃上清，PBS 洗涤细胞，采用全自动血液分析仪计数后，用含10%胎牛血清的RPMI1640 培养液调整细胞密度为1 × 109个／ L，备用。

1.5hUC-MSCs 与异体PBMCs 的共培养 参考文献［11-12］。试验分PBMCs 单独培养组（对照组）及hUC-MSCs 与PBMCs 共培养组，每组设3 个复孔。为去除hUC-MSCs 的增殖能力，保留其分泌生物活性物质的能力，用30 Gy 的60Co γ 射线照射预处理hUCMSCs。将hUC-MSCs 按3 × 104个／ 孔接种24 孔板，分别按1 ∶5 和1 ∶10 的比例与PBMCs 共培养，依次加入25 mg ／ L PHA，将培养板进行8 字形混匀后，置37 ℃，5% CO2培养箱培养5 d；采用全自动血液分析仪计数活化PBMCs 的数量。

1.6hUC-MSCs 对异体PBMCs 免疫调节作用的检测 采用流式细胞术。收集各组细胞悬液，进行细胞计数后，300 ×g离心5 min，弃上清，用含0.1%BSA 的PBS 洗涤细胞1 次，用100 μL 含0.1% BSA的PBS 重悬细胞沉淀，加入鼠抗人单克隆抗体CD3-PECY7、CD4-FITC、CD25-APC 和CD127-PE，4 ℃避光孵育30 min；用含0.1% BSA 的PBS 洗涤细胞1 次，用400 μL 含0.10% BSA 的PBS 重悬细胞，上流式细胞仪检测CD4+CD25+CD127dim／-Treg 细胞百分比。按下式计算hUC-MSCs 对PBMCs 增殖抑制率。

2 结 果

2.1hUC-MSCs 的培养及鉴定 倒置显微镜下观察可见，hUC-MSCs 为贴壁生长的梭形样细胞，见图1A；hUC-MSCs 在向成脂肪样细胞分化过程中，细胞形态从变为圆形或多边形逐渐到胞质内有小空泡样结构出现，随诱导时间延长，胞质内的小空泡样结构增多，并互相融合成“葡萄串”，油红O 染色显示胞质内有大量红色成熟脂滴沉积，见图1B；茜素红染色后呈紫红色，表明hUC-MSCs 分化为成骨样细胞，有钙盐形成并沉积，见图1C；阿利新蓝将软骨小球中分化细胞染为蓝色，表明hUC-MSCs 分化为成软骨样细胞，见图1D，在hUC-MSCs 向成软骨样细胞分化过程中有硫酸软骨素和氨基聚糖等酸性黏多糖产生。

图1 hUC-MSCs 的形态观察及鉴定Fig.1 Morphological observation and identification of hUCMSCs

2.2hUC-MSCs 对异体PBMCs 增殖的抑制作用 倒置显微镜下观察可见，PBMCs 呈悬浮生长，细胞为圆形或椭圆形，折光性好，形态大小较为一致，在PHA作用48 h 后，细胞体积变大，随培养时间延长，细胞数量明显增多，聚团细胞增多，细胞团增大，呈聚团和／ 或散在分布，见图2A；单独培养组悬浮细胞数量明显多于共培养组，见图2B。hUC-MSCs 与PBMCs以1 ∶5 和1 ∶10 比例共培养5 d，hUC-MSCs 抑制PBMCs 增殖率分别为（81.54 ± 5.10）%和（43.37 ±3.35）%，高于单独培养组。

图2 倒置显微镜下观察培养中细胞Fig.2 Inverted microscopy of cells in culture

2.3hUC-MSCs 对PBMCs 中Treg 细胞亚群的调节作用 hUC-MSCs 与PBMCs 以1 ∶5 和1 ∶10 比例共培养5 d，流式细胞术检测显示，共培养组中CD4+CD25+CD127dim／-Treg 细胞亚群百分比分别为（3.64 ± 0.49）%和（2.61 ± 0.26）%，见图3。与对照组［（2.11 ± 0.14）%］比较，hUC-MSCs 促进Treg细胞亚群增殖，上调效率分别为（41.73 ± 4.66）%和（19.39 ± 5.62）%。

图3 CD4+CD25+CD127dim／-Treg 细胞亚群流式图Fig.3 Flow cytometry of CD4+CD25+CD127dim／-Treg cell subsets

3 讨 论

MSCs 是存在于多种组织器官间质中的一类成体干细胞，主要通过组织块贴壁法、酶消化法进行原代培养，经酶消化法传代扩增、纯化细胞［10，13］。目前主要从3 个方面进行MSCs 的鉴别［14］，即形态学观察到细胞贴壁生长，梭形，似成纤维细胞；细胞表型为CD73、CD90 与CD105 阳性细胞百分比≥95.0%，而CD34、CD45、HLA-DR、CD14 或CD11b、CD79a 或CD19 的阴性细胞百分比≤2.0%；MSCs 具有成脂、成骨以及成软骨的分化潜能。本研究采用前期课题组建立的组织块贴壁培养法获取的hUC-MSCs（已完成hUC-MSCs 表型鉴定［10］），观察到hUC-MSCs 具有分化为成脂肪样细胞、成骨样细胞和成软骨样细胞的潜能，提示本研究平台制备的hUC-MSCs 符合国际干细胞协会制定的鉴定标准［10，14］。

MSCs 具有向受损组织器官归巢，通过自分泌和／或旁分泌改善局部微环境，以及多向分化潜能和独特的免疫调节特性等特点，使其在临床细胞治疗研究中发挥着重要作用［2，5-6］。MSCs 制剂的临床安全性和有效性受其质量属性的影响，其中免疫调节特性是评价MSCs 临床疗效最为相关的重要质量属性之一［8-9］。本研究将hUC-MSCs 与PBMCs 以1 ∶5 和1 ∶10 的比例共培养5 d，采用全自动血液细胞分析仪检测活化PBMCs 数量，流式细胞仪检测CD4+CD25+CD127dim／-Treg 细胞亚群百分比，观察到hUC-MSCs抑制异体PBMCs 增殖，而促进Treg 细胞亚群分化，其作用强度与hUC-MSCs 数量成正比，即有剂量依赖性；与韩晓燕等［9］、刘梦婷［12］等、POLTAVTSEV等［15］报道一致。以上结果提示，hUC-MSCs 发挥免疫负调节作用。

已有的研究表明，MSCs 抑制活化PBMCs 增殖作用不受刺激淋巴细胞活化因子类型的影响［12，15-16］。刺激淋巴细胞活化的因子有PHA、刀豆蛋白A、葡萄球菌A 蛋白、美洲商陆有丝分裂原、CD2 mAb、CD3 mAb 和IL-2 等非特异性免疫刺激剂，以及特异性抗原，其中应用较为广泛的是PHA。POLTAVTSEV等［15］观察到hUC-MSCs 抑制PHA 活化的PBMCs，Transwell 间接培养使MSCs 对PBMCs 增殖的抑制作用显著降低。TSE 等［16］用CD3 nAb 和CD28 CD3 nAb 刺激PBMCs，与人骨髓MSCs 共培养7 d 后，用3H-胸腺嘧啶核苷掺入法检测活化PBMCs 的增殖情况，结果显示，MSCs 显著抑制了PBMCs 增殖。本课题组已报道MSCs 抑制CD3-mAb 联合IL-2、IFNγ 等活化的DC-CIK 细胞增殖以及TNF-α 等细胞因子的释放［17］。在hUC-MSCs 与PBMCs 共培养体系中，预处理MSCs 的培养体系类似单向混合淋巴细胞反应，其预处理方法常用的有细胞周期非特异性抑制剂丝裂霉素C 或60Co γ 射线照射［11-12，18-19］，目的是抑制其增殖而保留分泌生物活性物质的能力；如果不对MSCs 进行预处理，其培养体系类似双向混合淋巴细胞反应。已有研究表明，MSCs 抑制异体PBMCs增殖的能力不受MSCs 是否接收预处理的影响，均可观察到MSCs 有抑制PBMCs 增殖的能力［12，17-18，20］。

PBMCs 包括淋巴细胞和单核细胞，以T 淋巴细胞为主。获取PBMCs 的常用方法是密度为1.077 ±0.002 2 的Ficoll-Hypaque（聚蔗糖-泛影葡胺，也称淋巴细胞分离液）密度梯度离心法［12，17］，但获得的PBMCs 中会混杂有约10%的其他血细胞。为获取纯度高的T 淋巴细胞，可选用免疫磁珠、流式分选、亲和板结合分离、脱脂棉柱与尼龙棉柱等方法［21-22］，但面临费用、技术平台等因素的限制。另外，当前由于国家法律法规对血源的管理，限制了实验室长期稳定大量获取健康个体人群PBMCs 的来源，对于评价不同批次、相同批次不同代次MSCs 的免疫调节能力时，面临结果重复性、可比性差的问题；因此有必要考虑建立健康人群永生化免疫细胞库的问题。

Treg 细胞是T 细胞的一个重要亚群，对维持机体免疫动态平衡具有重要作用，其数量的增加和／或功能异常可导致自身免疫性疾病［23］。Treg 细胞亚群是CD4 阳性细胞中的一类免疫调节细胞，其细胞膜表面高表达CD25 是其主要特点之一。目前用于检测Treg 细胞的标记物组合主要有CD4+CD25+CD127dim／-与CD4+CD25+FOXP3+；CD127 为IL-7α链受体，在CD4+CD25+Treg 细胞中的表达呈持续性低水平；而Foxp3 为转录抑制因子，需要进行破膜后检测［23-24］。因此，本研究选用检测Treg 细胞亚群的方案为CD4+CD25+CD127dim／-，在体外观察到hUCMSCs 促进Treg 细胞分化，提示其发挥免疫负调节特性。已有研究表明，MSCs 通过分泌生物活性物质影响不同类型免疫细胞的增殖分化，大部分哺乳动物来源的MSCs 分泌IDO 为主的免疫负调节分子，而小鼠来源的MSCs 以上调NO 为主发挥抑制淋巴细胞增殖的作用［25］。MSCs 的生物学特性受微环境的调节，MSCs 发挥免疫负调节作用还是免疫调节作用由微环境中炎症介质的种类和浓度决定［4，10］。即MSCs 免疫原性具有可塑性，其表型可极化为MSC1 和MSC2［4，25-26］。MSC1 为促炎表型，MSC2 具有免疫抑制特性。但静息状态的MSCs 为免疫原性较弱的细胞，不表达或低表达HLA-DR、CD40、CD80 及CD86等T 细胞活化需要的第二信号分子。然而，在急性炎症反应微环境中有高浓度的TNF-α、IFNγ 等炎性因子存在，或TLR3 激活剂作用下，MSCs 极化为抗炎的MSC2，有利于促进组织的损伤修复。另一方面，在IL-10、TGF-β 等抗炎因子存在，或TLR4 低剂量，短时间的刺激下，静息状态的MSCs 极化为促炎的MSC1，有利于启动组织损伤早期的免疫应答。鉴于此，MSCs 是在炎症微环境“授权”后激活免疫调节特性。但是MSCs 表型极化的分子机制尚不十分清楚，加之机体内病理微环境存在时空动态变化，这无疑为制定MSCs 治疗方案、疗效评价增加了复杂性，提示MSCs 的临床应用工作仍任道重远。

综上所述，本研究证实，hUC-MSCs 在体外抑制PBMCs 增殖及促进CD4+CD25+CD127dim／-Treg 细胞亚群表达上调，揭示hUC-MSCs 在体外淋巴细胞增殖试验中发挥免疫负调节作用。通过检测hUCMSCs 抑制活化PBMCs 增殖、促进Treg 细胞亚群增殖的能力可作为评价hUC-MSCs 生物学有效性的指标之一。