环状RNA hsa_circ_0004771 基因干扰对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响

李德珍，冯翎，余洛潇，常国栋

1.武汉大学人民医院肿瘤科，湖北 武汉 430060；2.湖北中医学院附属医院肿瘤科，湖北 武汉 430000

骨肉瘤是儿童和青少年最常见的原发性骨恶性肿瘤之一，占20 岁以下人群骨癌的56%［1］。化学疗法和手术治疗使骨肉瘤患者的5 年总生存率从10%提高至70%，但对于有转移或存在耐药性的病例，预后仍较差［2］。因此，迫切需要寻找骨肉瘤的新治疗策略。

环状RNA（circRNA）是一类内源性RNA，由无5'→3'极性的闭环结构结合在一起，通过充当microRNA 来调节转录或转录后基因的表达［3］。有报道表明，许多circRNA 可作为癌症诊断和治疗的标志物，包括肝癌、胃癌和肺腺癌等［4-6］。目前，尚无有关骨肉瘤与circRNAhsa_circ_0004771相关性的研究，本研究旨在探究circRNAhsa_circ_0004771基因干扰对骨肉瘤细胞生长及凋亡的影响，为骨肉瘤新治疗策略的研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1细胞及干扰序列 人成骨肉瘤MG63 细胞株购自中国典型培养物保藏中心；3 对hsa_circ_0004771基因干扰序列（shRNA1 ～3）及阴性对照序列（shRNANC）由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

1.2主要试剂 DMEM 培养基、胎牛血清（10082-147）、胰蛋白酶及青-链霉素均购自美国Gibco 公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒JC-1、EdU 细胞增殖检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒及HRP 标记的山羊抗兔IgG均购自上海碧云天生物技术研究所；Hoechst 双染试剂盒、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；兔抗Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved Caspase-3、c-Myc、β-actin 单克隆抗体均购自英国Abcam 公司。

1.3细胞培养 将MG63 细胞用DMEM 培养基（含10%胎牛血清和1%青-链霉素）于37 ℃，5% CO2恒温培养箱中培养，每3 d 更换1 次培养液。

1.4shRNA 干扰效果的检测 取对数生长期的MG63 细胞，用LipoRNAiTM转染试剂将hsa_circ_000-4771shRNA1、shRNA2、shRNA3 及shRNA-NC 序列分别转染至MG63 细胞，同时设空白对照组（不转染）。转染后72 h，Trizol 试剂提取各组细胞总RNA，反转录合成cDNA，以其为模板进行PCR 扩增。PCR 反应条件为：95 ℃30 s，95 ℃10 s，60 ℃30 s，共35 个循环。以β-actin为内参基因，2-△△CT法计算各目的基因相对表达量。

1.5hsa_circ_0004771基因抑制对MG63 细胞EdU阳性细胞数影响的检测 按1.4 项方法将MG63细胞分为shRNA 组（选择干扰效果最佳的干扰序列）、shRNA-NC 组及空白对照组。取对数生长期的各组MG63 细胞，按每孔1×105个接种于96 孔板，37 ℃培养过夜；加入含50 μmol ／ L EdU 的DMEM 培养基，100 μL ／ 孔，37 ℃孵育2 h；PBS 洗涤2 次，每次5 min，加入4%多聚甲醛，室温孵育30 min；加入2 mg／mL 甘氨酸，继续孵育5 min；加入0.5%TritonX-100 渗透液，继续孵育10 min；加入Apollp 染液，避光30 min；加入Hoechst 33342，室温孵育2 min；PBS洗涤2 次，每次5 min。置荧光显微镜下观察。

1.6hsa_circ_0004771基因抑制对MG63 细胞凋亡率影响的检测

1.6.1流式细胞术 细胞分组同1.5 项，取对数生长期的各组MG63 细胞，0.25%胰酶消化，PBS 洗涤2 次，加入195 μL 的Annexin V-FITC 结合液重悬细胞；加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL 碘化丙啶染色液，混匀，室温避光孵育20 min，用流式细胞仪检测。

1.6.2Hoechst 染色 取对数生长期的各组MG63细胞，按每孔1 × 105个接种于6 孔板，加入0.5 mL Hoechst 染色试剂盒中的固定液，37 ℃固定10 min；PBS 洗涤2 次，加入0.5 mL Hoechst 33258 染色液，染色5 min；PBS 洗涤2 次，取一滴置玻片上，于荧光显微镜下观察。

1.7hsa_circ_0004771基因抑制对MG63 细胞线粒体膜电位影响的检测 细胞分组同1.5 项，取对数生长期的各组MG63 细胞，按3 × 105个／ 孔接种于6 孔板，PBS 洗涤3 次，37 ℃孵育24 h；加入5 μg／mL的JC-1，室温避光反应30 min；用流式分选仪检测，记录红色和绿色荧光强度。

1.8hsa_circ_0004771基因抑制对MG63细胞中MDA及LDH 含量影响的检测 细胞分组同1.5 项，取对数生长期的各组MG63 细胞，采用相应试剂盒测定LDH 和MDA 含量。

1.9hsa_circ_0004771基因抑制对MG63 细胞中Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、Caspase-3、c-Myc 表达水平影响的检测 采用Western blot 法。细胞分组同1.5项，取对数生长期的各组MG63 细胞，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取总蛋白，BCA 试剂盒测定蛋白含量。取等量蛋白质样品，经12% SDS-PAGE分离后，转移至PVDF 膜，用TBST 稀释的5%脱脂牛奶于4 ℃封闭2 h；加入兔抗Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、Caspase-3、c-Myc、Actin 单克隆抗体（均按1 ∶1 000 稀释），4 ℃孵育过夜；TBST 洗涤3 次，加入HRP标记的山羊抗兔IgG（1 ∶10 000 稀释），4 ℃孵育2 h；用双蒸水终止反应，ECL 显色。ImageJ 软件统计灰度值。目的条带相对表达量以目的蛋白与β-actin灰度值比值表示。

1.10统计学分析 应用GraphPad Prism 5 统计学软件进行统计分析，数据均以均值± 标准差（±s）表示，两组间比较采取t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1shRNA 的干扰效果 shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA-NC 及空白对照组MG63 细胞中hsa_circ_0004771基因相对表达量分别为0.15 ± 0.06、0.48±0.08、0.60±0.09、0.99±0.05、1.00±0.01。与空白对照组比较，shRNA-NC 组MG63 细胞中hsa_circ_0004771基因相对表达量差异无统计学意义（t=0.340，P> 0.05），shRNA1、shRNA2、shRNA3 组均显著降低（t分别为24.204、11.171、7.651，P均＜0.05），其中shRNA1 的干扰效果最好，因此选择shRNA1 进行后续试验。

2.2hsa_circ_0004771基因抑制对MG63 细胞EdU阳性细胞数的影响 shRNA1、shRNA-NC 及空白对照组EdU 阳性细胞数分别为（18.79±9.68）、（92.32±7.12）、（88.62±8.59）个。与空白对照组比较，shRNA1组EdU 阳性细胞数明显降低（t= 9.346，P＜0.05），shRNA-NC 组差异无统计学意义（t=0.574，P>0.05）。见图1。

图1 各组MG63 细胞的EdU 阳性细胞数（EdU 染色，× 200）Fig.1 Counts of EdU positive cells in MG63 cells of various groups（EdU staining，× 200）

2.3hsa_circ_0004771基因抑制对MG63 细胞凋亡率的影响

2.3.1流式细胞术 shRNA1、shRNA-NC 及空白对照组MG63 细胞凋亡率分别为（28.93 ± 2.76）%、（5.38±1.21）%、（5.42±0.83）%。与空白对照组比较，shRNA1 组MG63 细胞凋亡率明显升高（t=14.129，P＜0.05），shRNA-NC 组差异无统计学意义（t=0.047，P> 0.05）。见图2。

图2 流式细胞术检测各组MG63 细胞的凋亡情况Fig.2 Flow cytometry of apoptosis of MG63 cells in various groups

2.3.2Hoechst 染色 shRNA1、shRNA-NC 及空白对照组MG63 细胞凋亡率分别为（31.80 ± 2.12）%、（14.08 ± 1.06）%、（12.72 ± 1.06）%。与空白对照组比较，shRNA1 组MG63 细胞凋亡率明显升高（t=13.943，P＜0.05），shRNA-NC 组差异无统计学意义（t= 1.571，P> 0.05）。见图3。

图3 Hoechst 染色法检测各组MG63 细胞的凋亡情况（Hoechst 染色，× 200）Fig.3 Hoechst staining of apoptosis of MG63 cells in various groups（Hoechst staining，×200）

2.4hsa_circ_0004771基因抑制对MG63 细胞线粒体膜电位的影响 shRNA1、shRNA-NC 及空白对照组MG63 细胞线粒体膜电位分别为（2.73 ± 0.85）%、（53.13 ± 1.03）%、（51.26 ± 1.18）%。与空白对照组比较，shRNA1 组MG63 细胞线粒体膜电位明显降低（t= 57.800，P＜0.05），shRNA-NC 组差异无统计学意义（t= 2.068，P> 0.05）。见图4。

图4 各组MG63 细胞的线粒体膜电位Fig.4 Mitochondrial membrane potential of MG63 cells in various groups

2.5hsa_circ_0004771基因抑制对MG63细胞中MDA及LDH 含量的影响 shRNA1、shRNA-NC 及空白对照组MG63 细胞中MDA 含量分别为（4.10±0.50）、（2.36 ± 0.20）、（2.30 ± 0.30）mmol ／ L，LDH 含量分别为（1 776.62 ± 213.18）、（896.77 ± 198.61）、（878.94±245.08）U／L。与空白对照组比较，shRNA1组MG63 细胞中MDA 及LDH 含量显著升高（t分别为5.347 和4.787，P均＜0.05），shRNA-NC 组差异无统计学意义（t分别为0.288 和0.098，P均>0.05）。

2.6hsa_circ_0004771基因抑制对MG63 细胞中Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、Caspase-3、c-Myc 表达水平的影响 与空白对照组比较，shRNA1 组Bax ／ Bcl-2、cleaved Caspase-3／Caspase-3 比值明显升高（t分别为22.395 和7.593，P均＜0.05），c-Myc 蛋白表达水平显著降低（t=4.201，P＜0.05）；shRNA-NC 组Bax／Bcl-2、cleaved Caspase-3／Caspase-3 比值及c-Myc 蛋白表达水平差异均无统计学意义（t分别为0.775、1.225、0.541，P均> 0.05）。见图5 和表1。

表1 各组MG63 细胞中Bax／Bcl-2、cleaved Caspase-3／Caspase-3及c-Myc 的表达水平（ ± s，n = 3）Tab.1 Expression levels of Bax ／Bcl-2，cleaved Caspase-3／Caspase-3 and c-Myc in MG63 cells of various groups（x±s，n=3）

表1 各组MG63 细胞中Bax／Bcl-2、cleaved Caspase-3／Caspase-3及c-Myc 的表达水平（ ± s，n = 3）Tab.1 Expression levels of Bax ／Bcl-2，cleaved Caspase-3／Caspase-3 and c-Myc in MG63 cells of various groups（x±s，n=3）

注：a 表示与空白对照组比较，P ＜0.05。

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图5 Western blot 法检测MG63 细胞中Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、Caspase-3、c-Myc 的表达水平Fig.5 Determination of expression levels of Bax，Bcl-2，Caspase-3，cleaved Caspase-3 and c-Myc proteins in MG63 cells by Western blot

3 讨 论

circRNA 在生物系统中广泛表达，在哺乳动物细胞中高度保守，且较稳定，这些特性使circRNA 可能成为诊断各种癌症的理想生物标志物［7］。相关研究表明，hsa_circ_0004771是一个功能性circRNA 基因，在大肠癌患者血清的外泌体中高表达，对大肠癌有一定诊断价值［8］；hsa_circ_0004771在胃癌组织中的表达水平也上调，可作为胃癌的新型诊断和动态监测生物标志物［9］。

细胞增殖是恶性肿瘤的基本生物学特征，抑制肿瘤细胞增殖对临床治疗肿瘤有指导意义。HUANG等［10］研究发现，hsa_circ_0004771通过miR-339-5p ／CDC25A 轴抑制食管鳞状细胞癌增殖。本研究发现，hsa_circ_0004771shRNA 可明显降低MG63 细胞EdU阳性细胞数，提示基因干扰hsa_circ_0004771可抑制MG63 细胞增殖。促凋亡蛋白Bax 和抗凋亡蛋白Bcl-2 可相互作用，形成的复合物比例的高低可判定细胞凋亡状态［11］。细胞质中的Caspase-3 一般无活性，以procaspase-3 形式存在，当细胞受到凋亡刺激时，被激活，进而诱导细胞发生凋亡，当Caspase-3 活化时意味着凋亡进入不可逆阶段［12］。c-Myc 为原癌基因，可介导肿瘤细胞无限增殖，促进肿瘤细胞凋亡，相关研究表明，c-Myc 高表达可促进骨肉瘤的发生［13］。XIE 等［14］研究发现，敲除hsa_circ_0004771可抑制乳腺癌细胞系中的细胞增殖并诱导其凋亡。本研究发现，hsa_circ_0004771shRNA 干扰后可明显升高MG63 细胞Bax ／ Bcl-2、cleaved Caspase-3 ／Caspase-3 比值（P＜0.05），显著降低c-Myc 蛋白表达水平（P＜0.05）。提示干扰hsa_circ_0004771基因可诱导MG63 细胞凋亡。

氧化应激是一种复杂的动态过程，其特点是保持活性氧生成与抗氧化剂的活性及有效性之间的平衡。线粒体是真核生物进行能量代谢的主要场所，在自由基产生、细胞凋亡和衰老等生理病理活动中发挥着重要作用，是氧化应激的重要靶细胞器，当线粒体的正常生理功能受到破坏，导致线粒体膜电位下降，从而导致细胞发生凋亡［15］。MDA 是脂质过氧化的最终产物，MDA 的测定能反映脂质过氧化水平，间接反映出细胞损伤程度［16］。LDH 属于氧化还原类酶，参与机体的能量代谢，LDH 的含量高低反映了细胞的活力。本研究发现，hsa_circ_0004771shRNA可显著提高MG63 细胞MDA、LDH 含量（P＜0.05），明显降低线粒体膜电位的作用（P＜0.05），提示干扰hsa_circ_0004771基因可通过改善氧化应激调节MG63 细胞增殖和凋亡。

综上所述，hsa_circ_0004771基因干扰可抑制骨肉瘤细胞MG63 增殖，促进细胞凋亡，降低线粒体膜电位，改善氧化应激的作用。本研究为骨肉瘤新治疗策略的研究提供了实验依据。今后也将通过动物及临床水平验证hsa_circ_0004771基因干扰对骨肉瘤的作用及其作用机制。