中医药通过调控神经元凋亡治疗血管性痴呆研究进展*

王莹，张虹

成都中医药大学针灸推拿学院，四川 成都 610075

血管性痴呆(vascular dementia，VD)是由心脑血管疾病引起低灌注性、缺血性或出血性脑损伤继而造成认知功能丧失的综合征[1]。细胞凋亡为I型程序性细胞死亡，即受到各种因素刺激后，调控一系列水解酶介入的自主性细胞程序性死亡过程[2]。海马神经元是机体学习与记忆的高级神经中枢，死亡受体活化、线粒体损伤途径与内质网应激启动被视为3条经典的细胞凋亡通路。当海马神经元处于应激状态时，上述经典凋亡通路被活化，进而诱导B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cystein-asparate protease，Caspase)家族等凋亡基因，使海马神经元细胞程序性死亡，空间学习记忆力受损，机体出现认知功能减退[3-4]。近年来，中医药治疗VD的机制研究日益增多，大量研究表明中药可以通过干预凋亡相关基因或信号转导通路等途径，抑制VD神经元凋亡，保护脑组织。现将中医药干预VD的相关研究综述如下，旨在为临床研究提供依据。

1 凋亡相关基因

人体细胞凋亡相关基因种类丰富，当前研究较多的Bcl-2家族、Caspases家族、P53、血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)等基因参与了VD的发病过程。

1.1 凋亡相关基因在VD发病中的机制

1.1.1 Bcl-2家族Bcl-2家族成员有抗凋亡基因和促凋亡基因两大类，如Bcl-XL、Bcl-2等抗细胞凋亡基因，Bcl-XS、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)等促细胞凋亡基因。Bcl-2 与Bax作为调控凋亡的核心基因，其表达异常与细胞凋亡的发生密切相关[5]。正常状态下，Bcl-2与Bax的表达保持平衡以维持细胞代谢，在调控线粒体膜通透性、线粒体巯基的氧化还原状态和细胞色素C(Cytochrome C，Cyt-C)的释放中具有关键作用[6]。当Bax蛋白表达量较Bcl-2高时，同源二聚体Bax/ Bax上升，诱导细胞凋亡；当Bcl-2蛋白表达量较Bax高时，则同源二聚体Bcl-2/Bcl-2及异源二聚体Bcl-2/Bax上升，产生抗凋亡作用[7]。有研究表明，在分两次结扎双侧颈总动脉构建的VD大鼠模型中，海马CA1区出现大量神经元凋亡，Bcl-2、Bax蛋白水平显著上调，Bax蛋白上升趋势更为明显，证实了Bcl-2/Bax失衡诱导神经元凋亡可能是VD发生的重要病理基础[8]。促凋亡基因Noxa属于Bcl-2家族成员，可以通过P53转录依赖性方式被激活，其表达异常也与细胞凋亡直接相关[9]。

1.1.2 Caspases家族Caspases是一种与细胞凋亡密切相关的特异性半胱氨酸天冬酸蛋白水解酶，目前人体内共发现有14种，其中Caspase-3在细胞凋亡的过程中发挥核心作用，它最初以无活性的Pro-Caspases酶原形式存在于细胞质中，当凋亡信号传递到酶原后，保守的天冬氨酸残基经过蛋白水解转化成具有活性的Caspase-3，进而发挥细胞凋亡效应[10]。Caspases家族主要通过两大关键途径被激活，一种是死亡受体途径，另一种是线粒体途径。其中死亡受体通路中死亡因子Fas-L被Fas受体特异性识别并结合，Fas/Fas-L复合物反过来诱导Fas和Fas相关死亡结构域蛋白(Fas-associated protein with death domain，FADD)结合，导致FADD聚集和死亡效应结构域(death effector domain，DED)出现，FADD通过DED与Pro-Caspase-8相互作用，诱导质膜胞质区Pro-Caspase-8低聚化，形成巨大分子复合物即凋亡诱导信号复合体(death inducing signaling complex，DISC)，进而激活 Caspase-8，继之激活下游Caspase-3启动凋亡；线粒体途径主要是通过细胞应激使线粒体通透性增加，线粒体内Cyt-C被释放到胞质中，在胞质脱氧三磷酸腺苷(deoxyadenosine triphosphate，dATP)或ATP作用下，凋亡蛋白酶激活因子-1(apoptosis protease activating factor-1，Apaf-1)低聚化，Apaf-1 促使胞浆内Pro-Caspase-9、dATP和 Cyt-C 共同形成凋亡小体，进而激活Caspase-9/3，执行凋亡过程[11]。脑缺血发生后，Caspase-3被激活，进而诱导神经元细胞凋亡，此外，其还参与了两大凋亡通路中的重要环节[12-13]。

1.1.3 P53P53是一种常见的促凋亡基因，多被应用于抑癌领域，是当前研究热点。P53一般以低水平位于细胞核和线粒体内，可与DNA 发生特异性结合以保护基因组的完整性，参与调控细胞凋亡与衰老、细胞周期阻滞、促DNA自我修复等多种生物学过程[14]。当细胞受到各种异常信号刺激时，P53被激活，通过转录依赖性或转录非依赖性机制促进凋亡发生[15]。P53转录依赖性凋亡主要是通过介导上述两大关键途径转录多种促凋亡基因的表达，如Bax、Fas、Apaf-1等，从而引起凋亡[15-16]。P53转录非依赖性凋亡是活化的P53发生线粒体转位，与Bcl-2 蛋白家族相互作用后，使线粒体膜通透性增加，最终导致细胞凋亡[17-18]。有报道指出，P53高表达在介导慢性脑缺血神经细胞损伤中发挥关键作用[19]。朱燕珍等[20]研究发现，VD模型大鼠海马CA1区锥体细胞出现明显凋亡现象，P53、Noxa表达水平升高，且呈正相关，相关系数为0.918，提示P53、Noxa诱导海马神经元凋亡可能是VD的重要发病机制。

1.1.4 HO-1HO是参与血红素降解代谢过程中的限速酶，目前已发现其有3种亚型，分别是HO-1、HO-2和HO-3，其中HO-1被研究最多，又称热休克蛋白32，具有保护细胞、抗氧化损伤、抗炎、抗细胞凋亡等作用[21]。HO-1基因由4个内含子与5个外显子组成，其启动子具有多态性，在转录起始位点上游的5′端存在一些特殊的增强子成分[22]，包括应激反应、热休克反应、金属调节反应等调控元件，激活蛋白1(activator protein-1，AP-1)、核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)等结合位点[23]。多个增强子与转录基因相结合可活化HO-1基因，并影响其调控作用。HO-1的催化产物一氧化碳(carbon monoxide，CO)及胆红素同样具有抗凋亡、抗氧化、保护神经血管单元的作用[24]。另研究指出，CO也可以损害神经元细胞线粒体及其膜，诱导细胞坏死及凋亡[25]，可能与CO不同浓度产生的双重作用相关，低浓度可以对慢性脑缺血产生保护作用，反之高浓度则可引起神经毒性反应。

1.2 中医药调控凋亡相关基因研究周伟等[26]应用改良双侧颈总动脉阻断法构建VD模型大鼠，发现模型大鼠脑组织中Caspase-3、Bax的表达显著上升，Bcl-2表达显著降低；以低、高剂量的大蒜素干预模型大鼠后，Caspase-3、Bax表达显著下降，Bcl-2表达显著上升，表明大蒜素可以有效改善VD大鼠认知能力，其机制可能与促进抗凋亡基因表达密切相关。实验研究发现，川续断总皂苷能够通过降低海马CA1组织中聚ADP-核糖聚合酶[Poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]、Bax、Caspase-3表达，增加Bcl-2表达，从而减少神经元细胞凋亡，发挥脑保护作用[27]。邓敏贞等[28]制备VD模型小鼠发现，人参皂苷Rb3、β-细辛醚组以及两者联合用药均可明显下调Bax mRNA及蛋白表达量，上调Bcl-2 mRNA及蛋白表达量，发挥抗海马神经元凋亡的作用以改善VD。高玲等[29]应用双侧颈总动脉永久结扎法(2-VO)建立VD模型大鼠，结果发现益髓解毒法中药组方可以通过抑制大鼠海马组织Caspase-3、Caspase-9蛋白的表达，有效提高大鼠的学习记忆能力。王韵桥等[30]实验发现，五脏温阳化瘀汤的抗VD作用机制与上调Bcl-2、Bcl-XL表达，下调 Caspase-3、Caspase-9表达有关。吴林等[31]研究发现，温肺降浊方能够通过降低Caspase-3表达，抑制神经元凋亡，起到神经元保护作用。另研究发现，该方可通过降低大鼠海马区Cytc、Bax表达，发挥抗VD功效[32]。有研究发现，活血益智片抗VD的作用机理可能与其抑制P53与Caspase-3活性进而产生抗凋亡作用相关[33]。李建省等[34]研究发现，P53主要是通过激活促凋亡基因或线粒体途径诱导细胞凋亡，而通络益智散能抑制模型大鼠海马CA1区P53蛋白的表达，保护脑组织。高冬丽等[35]研究发现，P53的蛋白表达间接反映脑缺血模型大鼠神经细胞凋亡状况，证实了天麻素改善VD大鼠学习记忆能力的作用机理可能与下调P53表达从而抑制海马神经细胞的凋亡有关。实验研究发现，以黄蒲通窍胶囊干预VD大鼠28 d，可有效降低Fas表达水平，抑制Fas信号通路，进而抑制细胞凋亡，改善VD大鼠认知功能障碍[36]。郑攀等[37]观察补肾醒脑方对VD大鼠脑组织Fas和Bcl-2基因表达的影响，结果显示该方可以抑制脑缺血后Fas基因表达，升高抗凋亡Bcl-2基因表达。黄立武等[38]研究证实，益肺宣肺降浊方能够下调HO-1表达，减少大脑皮层CO的生成，减少其对神经细胞的毒性损伤，进而抑制细胞凋亡，有效改善大鼠认知能力。

目前，大量实验研究集中于中医药通过调控Bcl-2、Caspases家族相关基因干预VD，对P53与HO-1基因的研究较少，而研究已证实中医药通过调控HO-1的表达可发挥不同作用机制影响VD，如下调其表达，能减少神经毒性，抗凋亡；上调则可减轻氧化损伤，发挥脑保护作用[39]，可见，中医药对基因表达水平具有双向调节作用，可使疾病相关基因表达恢复动态平衡。

2 凋亡相关信号通路

2.1 凋亡相关信号通路在VD发病中的作用机制

2.1.1 p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路MAPKs是细胞内执行信号级联放大的一类蛋白质，能够针对细胞外不同的刺激调控细胞凋亡、分化、分裂等多个生理过程[40]。p38 MAPK是MAPKs家族一员，cleaved p38 MAPK可调控Bax向线粒体易位，从而激活死亡受体途径，导致神经元细胞凋亡[41]。有研究证实大鼠脑缺血缺氧后，大脑皮层内p38 MAPK表达升高且被激活，SB 203580脑室给药能够有效抑制p38 MAPK活化，改善血脑屏障(Blood-brain barrier，BBB)损伤和继发的脑水肿程度[42-43]。

2.1.2 脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)相关信号通路BDNF是一种由胶质细胞、脑血管内皮细胞、神经元等多种细胞合成的碱性蛋白，具有神经营养作用，与原肌球蛋白受体激酶B(tropomyosin receptor kinase B，TrkB)受体特异性结合后，可进一步诱导激活MAPK、磷脂酶(phospholipase C，PLC-γ)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)，促进抗凋亡、神经元增殖、长时程增强等，提高认知能力[44]。BDNF抗神经元凋亡的重要机制是增加细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)磷酸化水平[45]。PI3K/蛋白激酶B(serine/threonine protein kinase，Akt)是BDNF/TrkB的重要下游转导通路，参与细胞增殖、凋亡和自噬等多种细胞生理病理过程，同时与脑缺血后细胞凋亡的调控有着密切联系[46]。

2.1.3 沉默信息调节因子1/过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子-1α(silent information regulator 1，SIRT1/ peroxisome-proliferotor-activated receptorγcoactjvator-1α，PGC-1α)信号通路SIRT1属于Sirtuin蛋白家族成员，是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖性核乙酰基酶[47]，参与细胞凋亡、自噬、新陈代谢、神经保护等重要生物学过程。PGC-1α作为其下游信号，是线粒体生物合成过程中的关键性调节因子，在体内能量代谢方面发挥着重要作用。SIRT1/PGC-1α信号转导通路能够去乙酰化活性，激活三磷酸腺苷合酶β，发挥抗凋亡作用[48]。脑缺血缺氧后，神经元细胞处于氧化应激状况，其诱导细胞凋亡是脑缺血后神经损伤的重要病理过程，一些干预方式能够通过激活SIRT1/PGC-1α信号转导通路，减轻氧化损伤与神经元凋亡[49-50]。

2.1.4 PI3K/Akt/Bad信号通路PI3K/Akt信号途径被认为是调控细胞凋亡的重要通路，PI3K是由p85、p110两个亚基组成的一类胞内磷脂酰肌醇激酶。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，能磷酸化一系列蛋白成分，Akt家族存在3种亚型，分别为Akt1、Akt2 与Akt3，其功能各不相同[51]。Bad是关键促凋亡基因，作为Akt的重要下游分子，能被直接磷酸化，生成Bcl-2或Bcl-xl单体，从而发挥抗凋亡效应。研究发现，以眼针为干预手段治疗脑缺血模型大鼠，可以通过降低Bad表达水平，提高Bcl-xL表达水平，防止神经细胞凋亡，发挥保护神经血管单元的作用[52]。

2.1.5 PI3K/Akt/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路mTOR由mTORCl、mTORC2两种复合物组成，参与调控细胞自噬、凋亡等，被视为细胞活动的“中央调控器”[53]。PI3K/Akt/mTOR信号在上游或旁路分子刺激下被激活，直接磷酸化凋亡相关蛋白或通过调控凋亡相关基因表达途径实现抗凋亡作用，包括调节磷酸化Caspase-9，调控NF-κB、Bad活性，抑制P53、Cyt-C 释放等[54]。相关研究证明，激活该信号通路可以改善VD大鼠学习记忆力，实现脑保护功能[55]。

2.1.6 丝裂原活化蛋白激酶5/细胞外信号调节激酶5(mitogen-activated kinase，MEK5/extracellular signal regulated kinase，ERK5)信号通路MEK5属于MAPKK家族的成员，涉及抗凋亡等作用，由于缺乏特定抑制剂等相关生物制剂，当前研究较少，其下游分子ERK5信号转导通路是MAPK家族一员。研究显示，细胞凋亡与ERK5的缺失相关，ERK5是调控促凋亡蛋白Bad、BimL、BimEL的关键因子[56]。

2.1.7 ERK/环腺苷酸反应元件结合蛋白(cAMP response element bindingprotein，CREB)信号通路作为CREB上游分子，ERK能够磷酸化，发挥调控神经元凋亡等作用。CREB能够调控神经元生长、生存，参与长期的记忆形成过程及细胞内不同信号转导[57]。CREB活化后可调控多种基因转录，促使即刻早期基因产物表达，通过抑制神经元凋亡与增强修复，具有神经元保护功效[58]。

2.2 中医药调控凋亡相关信号通路的研究杨申等[59]采用2-VO法诱导VD模型大鼠，结果发现，以银杏叶提取物Egb761治疗15 d后，大鼠海马区 p-p38MAPK表达降低，通过抑制p38MAPK信号通路，延缓海马神经元细胞凋亡，提高空间学习记忆力。李欧等[60]实验发现，香萱益神方能够提高模型大鼠海马中海马组织BDNF表达水平，通过激活BDNF相关通路，减少海马神经元细胞凋亡，有效改善模型大鼠认知能力。于文涛等[61]研究发现，补肾活血方低、高剂量组均可以明显增加海马区BDNF、TrkB、PI3K、AKT表达水平，有效改善海马神经元凋亡细胞损伤，表明补肾活血方可能通过调控BDNF介导的PI3K/Akt信号转导通路发挥神经元保护作用。李永格等[62]研究证实，山茱萸多糖增强模型大鼠学习记忆力的机制与升高BDNF、Bcl-2表达水平、抑制凋亡有关。周罗可等[63]研究发现，五味子甲素干预模型大鼠后，可通过激活SIRT1/PGC-1α通路，下调Bax、cleaved Caspase-3/Caspase-3表达量，上调Bcl-2、SIRT1、PGC-1α表达水平，抗神经元凋亡。易亚乔等[64]研究发现，加味脑泰方可通过激活SIRT1相关通路，升高SIRT1、Bcl-2表达水平，降低Bax、Caspase-3表达水平，抑制凋亡。郜峦等[65]实验发现，脑络欣通可增加VD大鼠PI3K、Akt及神经生长因子(nerve growth factor，NGF)表达，降低Bad表达，激活PI3K/Akt信号通路，抑制细胞凋亡。张杰等[66]研究发现，补肾通络方可明显升高VD大鼠海马组织PI3K、Akt、mTOR表达，激活PI3K/Akt/mTOR通路，促进自噬，抑制凋亡。毛成远等[67]研究证实，中药三七皂苷Rg1可激活MEK5/ERK5传导通路，上调p-MEK5、p-ERK5表达，抑制神经元细胞凋亡。靳贺超等[68]研究发现，补肾活血方可激活ERK/CREB信号传导，抑制海马神经元凋亡。

3 结语

综上所述，中医药可通过调控多种凋亡相关基因或信号转导通路等，有效改善认知障碍，减少神经元凋亡，发挥脑保护作用。但细胞凋亡本身的复杂机制尚未完全阐明，中药介导神经元细胞凋亡防治VD的具体机制仍为今后研究的重点。目前，中医药调控凋亡治疗VD的实验研究还存在一定的局限：许多实验仅仅构建相关病种的动物模型作为研究对象，丢失传统中医证型特征，今后的研究应将辨证论治与凋亡研究相结合，制备中医证候学相关动物模型，运用中医基础理论框架，使其更具现代中西医结合实验特色；现有研究多以死亡受体途径与线粒体途径为主，较少涉及内质网应激作用的细胞凋亡机制方面；SIRT1/NF-κB通路、c-Jun 氨基末端蛋白激酶(c-Jun N-terminal protein kainse，JNK)通路也可调控凋亡治疗VD[69-70]，但中医药是否能够介导该通路减少神经元细胞凋亡，仍需实验验证；中医药多层面、多通道、整体性治疗疾病的特点决定了其信号转导通路可能不仅介导某一个靶点，其交叉性与复杂性可作为今后研究的重点难点。综上，中医药抗凋亡治疗VD的研究仍处于起步阶段，亟需进一步的研究。