抗中性粒细胞胞浆抗体检测方法学研究进展

邢娜娜，张娜丽，王文强，孙萌，李忠信

（郑州安图生物工程股份有限公司，河南郑州 450016）

抗中性粒细胞胞浆抗体（anti-neutrophilcytoplasmic antibodies,ANCA）于1959年首次在慢性炎症疾病患者被发现[1]，但直到1982年血管炎与中性粒细胞胞浆成分反应的自身抗体之间的关系才被明确[2]，人们才意识到ANCA与血管炎相关。1985年，van der Woude等[3]通过间接免疫荧光的方法在GPA患者中检测到这种抗细胞质抗体，并把这种细胞质分布的荧光模型称为C-ANCA。继C-ANCA之后，有学者报道了在系统性动脉炎和肾小球肾炎患者中产生核通过IIF方法发现了围绕细胞核周染色模式的自身抗体，即P-ANCA[4-5]。之后IIF得到了更多的关注与应用，一度被认为是检测ANCA的“金标准”。随着PR3和MPO的发现，以及蛋白纯化技术的进步，针对抗原特异性的检测也得到快速发展，包括酶联免疫的一、二、三代产品，免疫印迹、荧光酶免疫分析、化学发光、联合特异性抗原检测的IIF，以及高通量的多重微珠免疫法等多平台、多方法学，本综述将介绍不同的检测方法及其方法学之间的一致性。

1 ANCA的组成

抗中性粒细胞胞浆抗体是以中性粒细胞及单核细胞胞浆成分为靶抗原的自身抗体，包括人白细胞弹性蛋白酶（human leukocyte elastase,HLE）、乳铁蛋白（lactoferrin,LF）、蛋白 酶3（proteinase 3,PR3）、弹性蛋白酶（elastase,ELA）、溶酶体（lysozyme,LYS）、髓过氧化物 酶（myeloperoxidase,MPO）、天青杀素（azurocidin,AZU）、组织蛋白酶G（cathepsin G,Cath G）和杀菌/通透性增高蛋（bactericidal/permeability increasing protein,BPI）等。根据荧光模型，ANCA靶抗原可以分为胞浆型（cytoplasmic ANCA,cANCA）、核周型（perinuclear ANCA,pANCA）和非典 型（atypical ANCA,xANCA）。cANCA的主要靶抗原为PR3，pANCA的主要靶抗原为MPO。PR3是大小29～30KD弱阳性蛋白，属于丝氨酸蛋白酶家族成员之一。PR3的前体酶经过4次加工为成熟形式，主要存在于中性粒细胞的嗜蓝颗粒中；其生理抑制剂为α1-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin,α1-AT）[6]。抗PR3抗体主要见于韦格纳肉芽肿，是其特异性抗体，阳性率占70%～80%，且与病程、严重性和活动性有关。MPO是由2条重链和2条轻链组成的二聚体大分子蛋白，分子量150KD，等电点大于11；其生理抑制剂为铜蓝蛋白[7]。pANCA不如cANCA具有诊断特异性，pANCA阳性主要见于特发性坏死性新月体性肾小球肾炎（NCGN）、显微镜下多动脉炎（MPA），在GPA患者中也存在抗MPO抗体。pANCA患者的血管炎病变程度重，常有多系统损害。

2 ANCA的检测方法发展

随着检测技术的提高，ANCA的检测方法向多平台、多原理发展，常见的检测方法包括间接荧光法（IIF）、酶联免疫吸附法（ELISA，第一代、第二代、第三代等）、化学发光（CLIA）、荧光酶免疫吸附法（FEIA）、多重微珠法等。

2.1 间接免疫荧光 间接免疫荧光（IIF）是检测ANCA最先使用的手段，一般分为乙醇固定和甲醛固定两种形式。IIF检测的特点灵敏度高、特异性差；并且IIF主观性太强，对结果的判读需要很强的专业知识及丰富的经验。随着对ANCA研究的深入，越来越多的AAV患者被发现，检测工作量增加，对人工阅片要求越高。为了满足市场的需要，商业化自动阅片系统上市，比如INOVA公司的NOVA View、Medipan公司的Aklides系统、Immuno Concepts的Image Navigator、Euroimmun AG的EUROPattern等。自动阅片排除了人为的主观性，满足了工作量的需求。Knütter I等[8]比较了分别用Aklides系统自动阅片与人工阅片GA公司检测ANCA的乙醇和甲醇固定玻片，为了使主观性最小化，由两位经验丰富的研究者进行手工阅读，结果表明自动阅片与人工阅片一致性高。最近又发展了一种新型检测技术即GA公司的CytoBead ANCA[9]，将乙醇固定的中性粒细胞与包被纯化的PR3、MPO的珠子共同固定在同一个玻片上，乙醇固定的中性粒细胞位于玻片的中室，包被PR3、MPO的荧光珠子位于右室，其中包被PR3的是9μm的红色荧光珠子，包被MPO的是15μm的红色荧光珠子，这种检测技术提高了ANCA检测特异性。

2.2 第一代ELISA自从明确了cANCA、pANCA的靶抗原，一些实验室从中性粒细胞中纯化PR3、MPO蛋白，开始制备抗原特异性检测[10]。第一个商用ELISA试剂盒于1990年问世[11]，随后出现了很多ELISA厂家。这些ELISA检测技术原理将PR3/MPO蛋白直接物理吸附包被于微孔板中，被称为第一代ELISA。由于蛋白纯化技术不同，各个厂家检测结果差别较大且与IIF结果缺乏可比性[12]。此外，抗原直接吸附于微孔板造成抗原变形及表位遮掩，导致检测结果灵敏度差，造成漏检。

2.3 第二代、三代ELISA基于第一代ELISAs低敏感性的原因，蛋白质修饰新方法和不同的检测方法快速发展。所谓的第二代ANCA ELISA检测使用捕获分子（主要是抗体）与微孔板结合，抗原特异性结合固相上的抗体，这样可减少抗原的空间位阻，使表位尽可能地暴露，另外减少因抗原与固相直接结合导致的表位结构改变[13-14]。研究表明[13,15-16]，捕获法的灵敏度增加，并优于直接包被。主要厂家为欧洲诊断。第三代ELISA类似于第二代，为了充分暴露抗原表位，抗原在结合ELISA板时，利用锚定技术固定抗原[17-19]。抗原通过附着在ELISA平板表面的锚定分子与ELISA平板表面结合。与IIF相比，该方法提供了更好的表位可获得性，从而进一步提高了敏感性和特异性。Roggenbuck D等[19]分别用第一代、第二代、第三代ELISAs检测86例GPA患者、450例其他疾病和80例健康者，比较三代检测的特异性和灵敏度并绘制ROC曲线，得到的AUC分别为0.80（第一代，95%置信区间：0.76～0.83）、0.86（第二代，95%置信区间：0.82～0.89）和0.96（第三代，95%置信区间：0.94～0.98）。主要厂家为法迪亚EliA系统。

2.4 其他ELlSA利用直接包被微孔板原理进行PR3 ELISA检测时，有一种新方法是欧蒙公司开发的，即使用人天然和重组PR3抗原混合包被[20]。该研究表明[21-22]，这可能比第一代间接法和第二代捕获法具有更高的灵敏度；然而，这并未在所有的研究中得到证实。

2.5 化学发光法 上世纪70年代中期，Arakawe首先报道了化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay,CLIA），发展至今已成为一种成熟的、先进的超微量活性物质检测技术，应用范围广泛。然而，ANCA化学发光检测是近几年才发展起来的。国外化学发光检测有INOVA的BIO-FLASH系统和A.Menarini公司的Zenit RA系统；国内化学发光厂家主要有苏州浩欧博、深圳亚辉龙、北京中航赛维、苏州长光华医。以INOVA的QUANTA Flash Lite®为例探讨一下化学发光法：纯化的抗原以共价键的方式化学连接到磁珠表面的官能团上，加入稀释后的样本与磁珠上的抗原反应，洗去未结合的非特异性抗体；加入带有标记的二抗孵育，加入底物收集并检测光信号。一项涵盖9个国家11个实验室的大型多中心研究证明，CLIA有高灵敏度和特异性[23]；在另一项研究中使用新开发的抗MPO抗体CLIA与三种不同的商用MPO检测法相比，CLIA法有相对较高的敏感性、特异性ROC曲线AUC面积0.96（95%置信区间：0.90～1.00）[24]；国内一项研究比较浩欧博化学发光与欧蒙ELISA之间的符合率，PR3-ANCA阳性符合率35.1%、阴性符合率96.1%、总符合率86.8%；MPO-ANCA阳性符合率81.9%、阴性符合率98.8%，总符合率93.8%[25]。

2.6 多重微珠免疫法 多重微珠免疫法（bead-based multiplex immunoassays,MBA）采用Luminex技术，其工作原理为：①编码微球，用不同配比的两种荧光染料将直径5.6μm的聚苯乙烯微球染成不同荧光色，从而获得多达100种不同荧光编码的微球；②把针对不同待测物质的蛋白以共价交联的方式结合到特定编码的微球上，每个编码微球都对应相应的检测项目；③把针对不同待测物的荧光编码微球混合，然后加入待测物，形成的复合物在与标记荧光素结合反应；④微球成单列通过两束激光，一束判定微球的荧光编码，另一束测定微球上的荧光素的荧光强度。使用多重微珠免疫法检测ANCA的主要厂家有宙斯（Zeus）的AtheNA Multi-Lyte®和伯乐（Bio-Rad）Bio-Plex®2200。2009年伯乐公司评价Bio-Plex®2200，在一个反应里可以同时检测ANCA三个项目（PR3、MPO、GBM），且具有相对较好的灵敏性和特异性[26]。另一项研究比较了Bio-Plex®2200与INOVA QUNATA Lite，MPO-ANCA符合率为70.4%（n=81；95%置信区间：59.7%～79.2%），PR3-ANCA符合率为76.5%（n=81；95%置信区间：66.2%～84.4%）[27]。

2.7 其他方法 除上述方法外，检测ANCA方法还有斑点/线性免疫印迹法、侧向层析检测（LFA）、可寻址激光珠免疫分析法（ALBIA）等。根据不同固定及标记工艺，每种方法均有各自特点。

3 总结

IIF作为发现ANCA的检测方法，在早期检测中占有优势地位，长期以来被人们当作检测的“金标准”。1999年国际共识中提到疑似ANCA首先用IIF进行筛选，再用抗原特异性检测确认[28]。由于IIF的特异性差，抗原纯化技术的提高，抗原特异性检测技术快速发展。1990年第一个商业化ELISA试剂盒上市，即为第一代ELISA。但其特异性好、灵敏度低，漏检情况严重。为解决这一问题，之后自身抗体厂家开发了“超敏”试剂盒以提高检出率。1998年以欧洲诊断为主的捕获法ELISA，2005年以法迪亚为主的荧光酶免疫法（FEIA）、2007年以法迪亚为主的锚定ELISA法、2012年化学发光法还有最近发展的多重微珠法等，相比第一代ELISA灵敏度和特异性均有提升。随着抗原特异性灵敏度的提高，2017年重新修订了国际共识，共识建议GPA、MPA患者可以直接用高质量的特异性检测ANCA（第二、三代ELISA、化学发光法、FEIA、多重微珠）[29]。然而，有些实验室检测ANCA已经排除IIF，其实这是对共识的误解。

多平台多方法的联合使用，是提高ANCA检测准确性的必要手段。但由于抗体的异质性、各厂家使用的抗原及标记的不同，各个厂家检测结果差别较大。尽管美国CDC发布了参考血清（PR3-ANCA Human Reference Serum #16、MPO-ANCA Human Reference Serum#15），2016年开始也有参考物质（MPO：ERM®-DA476/IFCC[30]和PR3：ERM®-DA483/IFCC[31]），可能各厂家的溯源标准不一致，检测结果仍然不一致。虽然联合检测是必要手段，但仍不能确定哪种方法、哪个厂家检测最为科学、准确。目前统一标准是ANCA检测急需解决的问题。