CFS大鼠模型的建立与评价*

马菲，张小凡，李华南,3△

（1.天津市中医药研究院附属医院，天津 300120；2.天津中医药大学第一附属医院，天津 300193；3.国家中医药管理局推拿手法生物效应三级实验室，天津 300193）

慢性疲劳综合征作为一种临床常见疾病，患者常表现出不可名状的心理与生理性疲劳。除疲劳的主要症状外，患者还伴随有记忆力下降或注意力不集中、咽喉肿痛、淋巴结大、肌肉酸痛、无红肿的多关节疼痛、其他形式的头痛、不能解乏的睡眠等。该病多发生于35～50岁之间的上班族，且女性发病率高于男性，给患者及家庭带来了巨大的危害，学界一直在寻求有效的治疗方案。近年来，中医药在该病的治疗上取得了一定进展，特别是推拿疗法的干预，使得患者的疾病得到了缓解与恢复。但限于其发病机制尚未明确，无法从病理实质上阐释其作用途径与干预机制；加之，CFS在临床上尚无特异性检测方法及诊断指标，其诊断主要依赖于医生对于患者临床表现的判断[1]。因此，建立CFS动物模型，探究其相关标志物的特异性检测能够为临床上针对CFS研究提供基础实验及技术支撑[2]。

目前，多数学者认为慢性疲劳综合征的发生是机体面对应激时产生的慢性反应。应激作为一种非特异性全身反应，在机体遇到各种紧张性刺激物时所产生的交感神经-肾上腺髓质和下丘脑-垂体-肾上腺皮质系统兴奋反应的一种生理和心理反应。适度的应激能够提高机体对于外界刺激的适应能力，维持细胞内外环境稳态；而过度的应激则会产生负面效应，引起人体的应激性相关疾病，CFS正属于此列[3]。因此，基于以上考虑，学界逐渐在探索通过慢性应激刺激法来使得实验动物产生一定的CFS疾病特征，达到建立CFS动物模型的目的。

CFS动物模型主要分为单一和复合应激模型两种类型，两种应激模型的区别在于应激的手段、刺激频次、种类各有不同，但主要均通过建立孤独、挫败、恐惧环境及禁食水等多种模式、多种形式来建立动物心理及生理应激模型。研究过程中，可以根据实验所需的动物选用不同应激反应类型以建立相应的动物模型[4]。这样能够更好地建立动物模型，了解各种干预手段，特别是中医药手段干预的效应途径，为临床与科学研究提供支持。

1 生理疲劳为主造模

1.1 游泳法

游泳法是最常用的疲劳造模方法，其具有易操作、可重复等优势，得到许多学者的认可。其中，短时间冷水游泳法为达到躯体疲劳的刺激，将大鼠每日随机时间在10℃的冷水中进行游泳运动，每次6～10min，通过体力消耗刺激、寒冷刺激、强制性精神刺激等多种应急因素对大鼠进行应激性刺激[5]；同时，为避免大鼠在实验过程中对特定时间、频率、强度的应激刺激产生适应性反应，实验在每天的随机时间开始，并随机改变造模时间。长时间常温游泳法主要为强迫大鼠游泳1次/日、25min/次、水温22±2℃，连续游泳28天[6]；也有方法是让大鼠一直在4℃的冷水中游泳30min[7]，将寒冷刺激及力竭游泳刺激强度均大大提高，但同时由于大鼠长期处于低温环境和体力不支的状态下，增加了动物造模的死亡率。上述造模实验的时间不一，大致在7～21天不等。国外部分研究[8-10]建立了短时间常温游泳法：强制大鼠在水池（25cm×12cm×25cm）中游泳6min，水深15cm，水温22±3℃，连续7天进行大鼠游泳造模。大鼠在下水初期体力充沛，随着游泳时间的增加，体力降低，会在水面漂浮，即四肢无游泳动作，头部浮出水面。实验人员在记录大鼠游泳期间出现不游动的总时间，来判断疲劳造模是否成功。大鼠在水下不动时间的状态被认为与CFS特征相似。另外，还有负重力竭游泳：通过进行慢性负重力竭游泳法建立CFS大鼠模型：强制大鼠在水桶（深50cm）内进行其体质量5%的负重力竭游泳实验，水温30±2℃，1次/日，共游泳21天[11]。实验过程中，当大鼠由于疲劳而不做游泳运动时，用木棍驱使其继续游泳，直至大鼠游泳动作明显不协调，且沉入水下10s而不能上浮作为达到力竭的标准。

近年来，针对CFS造模的方法多采用强制冷水游泳，其中包含了温度、体力、精神等方面的刺激源。由于引起慢性疲劳的因素并非单一方面的生理因素，同时包括心理疲劳等也在起作用。因此，强制冷水游泳法不仅在躯体因素上进行体能消耗的刺激，也在强迫游泳活动中对动物施加了心理刺激。祖国医学认为，过劳是引起疲劳的一个重要原因。强迫游泳造模法正是应用这一医学理论，通过对大鼠施加长达数天的强制游泳运动，消耗大鼠体力，引起其四肢的倦怠、筋骨疲累。由于四肢过劳倦怠会影响大鼠脾胃消化功能，引起动物纳食减弱，气血生化减少，大鼠机能下降又进一步引起疲劳。而强制冷水刺激作为一种有害的精神刺激因素，既可引起动物的七情变动，也会引起运动疲劳，后文提到的跑台同样也是久行所伤。因此，强制冷水游泳法诱导的CFS模型能够更加趋向于真实情况下引起的慢性疲劳。

1.2 跑台法

跑台法是一种运动性疲劳造模法。史丽萍等[12]创建了一种造模法，具体方法为：将实验动物适应性饲养1周，正式实验2天前，各小鼠每天进行5～10min的跑台训练，速度为0.17m/s，以熟悉跑台。正式实验开始，各组动物跑台速度均为0.37m/s，过程中不断采用声触刺激，建立小鼠力竭性运动疲劳模型。

2 心理疲劳为主造模

2.1 单因素刺激

2.1.1 慢性束缚 对实验动物进行慢性应激性束缚实验是一种非常经典且可操作性极强的应激造模方法[13]，也是建立疲劳型亚健康大鼠模型的常用造模方法，其操作简单，对于实验室的仪器要求低，可重复性强，可以高度模拟临床慢性疲劳综合征和疲劳型亚健康特征。该方法的主要原理主要是利用啮齿类动物喜爱钻洞的习性，将动物束缚在狭小空间内，并限制其活动，保证其正常呼吸。也有研究报道[14]，为避免实验动物在实验过程中对实验规律产生适应性反应，因此每天的造模实验时间可不固定，可在此实验后每3天逐渐增加束缚时间，分别为1h、1.5h、2h、2.5h。慢性束缚实验主要通过限制动物躯体活动及逐渐增加的应激强度，使动物产生烦躁、挣扎、愤怒、绝望等一系列负性情绪，导致大鼠躯体及精神疲劳的发生，高度模拟CFS发病的社会心理因素。通过慢性束缚实验，动物大脑中海马结构的氨基酸递质的含量发生改变，导致中枢抑制占据优势地位，引起动物的疲劳、记忆力下降、抑郁[15]。亦有其他学者对束缚工具、时间等进行了一些改良，如随机选择束缚实验开始时间、自制玻璃材质的束缚管（束缚过程中不会产生额外的躯体伤害），以便更好地模拟产生心理疲劳效果[16-17]。

2.1.2 电刺激法 目前，除了慢性束缚，应用较多的是通过电刺激建立应激性疲劳状态模型，主要包括正常状态下电脉冲刺激和进食过程中给予电刺激两种方法。有研究[18]给予大鼠波宽2ms的电脉冲，刺激电流强度为1mA，每天刺激15次，每次间隔20s。电刺激足底法：张俊慧等[19]通过将盐水浸湿动物足底关节并固定电疗带，连接电针，频率10Hz，强度1.5V，每次刺激10min，每天2次，共2周。进食电刺激法：主要是在大鼠进食时，使用电路板电刺激[20]。

2.1.3 夹尾刺激法 夹尾应激法是通过对雄鼠进行激怒刺激，造成其心理疲劳，具体操作方法为：每日下午用包裹纱布的止血钳夹住大鼠尾部，刺激其与其他大鼠进行厮打，用以模仿人类在竞争压力的社会环境下的应激状态。该刺激每次持续刺激2h，连续刺激21天[7]。实验时应避免尾部出现伤口、出血现象。

2.1.4 其他 除上述方法外，还有睡眠剥夺法：实验动物每日进行睡眠剥夺20h，持续13天[21]。肾上腺皮质激素应用-停药法[22-24]：用醋酸氢化可的松注射液予以大鼠肌内注射，起始剂量为24.4～62.5mg/kg，用药期为3～14天，停药期为3～13天；或醋酸可的松注射液肌内注射，剂量为13.9～27.8mg/kg，用药期为7～17天，停药期为2～7天；以及悬吊法等造模方法，但相对应用较少。

2.2 复合因素刺激

韩娟[25]通过旋转、限制、拥挤三种方法对大鼠进行刺激模拟心理应激。旋转实验：将老式唱片机调节转速至45次/min，每日随机选择开始时间给予大鼠旋转刺激，为避免动物发生适应性反应，将实验次数设定为第1周1次/天，第2周2次/天，第3周1次/天，15min/次。限制实验：将模型组大鼠放入狭小空间，使得大鼠活动受限（大鼠不能转身），又要保证大鼠不能受到挤压，实验环境昏暗，每晚一次，第1周60min/次，第2周120min/次，第3周180min/次。拥挤实验：主要是将倍数的大鼠关入标准大鼠笼，造成拥挤应激。

3 身心疲劳造模（多重应激因素）

3.1 力竭游泳+剥夺睡眠

赵丽[26]采用睡眠剥夺联合力竭游泳法建立慢性疲劳大鼠模型，以造成模型大鼠的心理与生理疲劳。睡眠剥夺时间为20h：实验于每日固定时间将动物置于盒子内，并向内注入清水，刚没过大鼠四肢（高2cm）。使大鼠能够自由进食饮水，但却无法入睡，于次日将动物放入塑料游泳池（水深50cm）25±1℃进行一次力竭游泳实验，头部没入水中10s而未见浮出水面视为力竭，期间保证动物不被溺死，此联合刺激持续3周。

3.2 冷水游泳+束缚应激

张文静[27]采取冷水游泳联合躯体束缚建立大鼠应激模型，每日上午将大鼠置于自制的水桶（高90cm、直径60cm）内进行强迫游泳实验，水深40～45cm，温度15±2℃，观察大鼠，当动物出现力竭而沉入水中时及时救出；下午进行大鼠躯体束缚实验，将大鼠放入自制的束缚筒内，束缚时间1h，上述两种应激实验连续进行21天。杨启昭[28]则采用单日进行束缚实验，双日进行冷水游泳实验，两种刺激持续交替进行14天，与上述研究略有区分。

3.3 冷水游泳+夹尾

陈传伟[29]通过强迫冷水游泳联合夹尾巴共同刺激建立动物疲劳模型。开始造模后,模型组大鼠在单数日期进行冷水有用实验，双数日期进行夹尾实验（每次3min），每日进行躯体束缚实验（束缚时间为20min），连续21天给予上述刺激。

3.4 束缚+力竭游泳+夹尾刺激

王娜娜[30]、叶双双[31]等的方法是将大鼠置于束缚筒中，每3天增加束缚时间，连续束缚21天。在束缚实验期间交替联合给予力竭游泳实验和夹尾实验进行刺激，单日采用夹尾激惹刺激，夹尾实验的具体操作方法为：用夹子夹住大鼠尾部距离根部1～2cm的位置，以大鼠耐受且不脱落为标准。双日采用力竭游泳，将大鼠置于游泳池（深45cm）内，温度20±2℃，实验过程中记录大鼠自游泳开始至力竭状态的时间，力竭以大鼠头部下沉至水面下3s且未能自主回到水面且游泳动作异常为标准，每日实验的时间均不同。

3.5 睡眠紊乱+力竭游泳+慢性束缚刺激

金小千[32]采用睡眠剥夺、力竭游泳联合躯体束缚实验建立大鼠CFS模型。睡眠剥夺实验每日进行20h，于每日中午12:00开始。首先将饲养笼中的垫料清除，然后将笼内注入清水，水深以刚没过大鼠头部与四肢为标准，使大鼠无法进行正常睡眠，次日早8:00将大鼠取出。然后进行大鼠负重游泳实验，负重重量为大鼠体质量的5%，游泳环境水深35cm、水温21℃，5%负重游泳10天后，更换10%负重游泳，每次游泳时间20～25min，发现大鼠力竭后将大鼠救出。之后再继续使用束缚袋进行躯体束缚实验，使用铁丝将袋口扎紧，静置与实验室地面2h，连续进行21天。

3.6 束缚+睡眠紊乱+拥挤+跑台

张杨[33]通过联合躯体束缚、睡眠紊乱、环境拥挤、跑台运动等多因素应激源构建大鼠CFS模型。每日上午11点，强制大鼠进行炮台运动，速度为20m/min，运动时间为1h；下午2点，将大鼠置于自制束缚筒，造成大鼠活动受限2h。大鼠进行束缚实验及强制运动实验的3h外，其余时间均饲养在35cm×25cm×15cm的拥挤饲养箱环境中，并接受定时噪音刺激。

3.7 束缚+跑台+悬吊+游泳

尹喜玲的[14]CFS建模方法造模时间共12天。束缚联合跑台组：大鼠上午进行束缚刺激实验，下午进行跑台刺激训练。为避免大鼠适应刺激，每3天增强1次实验时间。跑台实验则先进行适应性训练后，逐渐加入跑台力竭性训练，依次递增跑速，直至大鼠力竭。悬吊游泳组：大鼠上午进行悬吊实验，下午进行负重游泳实验，连续12天。悬吊刺激实验每3天加时1次，时间分别为1、1.5、2、2.5h。正式游泳实验的前3天进行适应性训练，游泳时间为30min，负重小鼠体质量的3%。

3.8 多种应激随机组合

高春风[34]采用多刺激源联合随机组合建立应激疲劳模型，首先每天进行一次5%的负重力竭游泳实验，然后采用随机选取的多刺激因素方式进行刺激：包括禁食12h，禁水12h，光源干扰，夹尾1min，110dB超声刺激持续1h，1mA、30V足底电击5次，每隔1min刺激1次，30s/次。上述刺激源每天随机选取两种进行动物造模，防止老鼠适应性反应。同时Farhan H等[35]也采用多因素联合刺激方法建立模型，使动物无法适应未来的刺激实验，避免适应性反应造成的实验影响，具体实验方法为：连续10天给予大鼠不可预知的慢性温和性刺激，期间在实验的第1天、第6天将大鼠置于4℃的房间中50min，第2天、第7天将饲养笼倾斜并颠簸60min，第3天、第8天限制大鼠生存空间并限制其活动，第5天、第10天进行昼夜节律干扰3h。

4 模型检验

慢性应激动物模型若能够有效、科学地代表CFS等疾病，一般应具有下列特点[36]：（1）行为表现的高度相似性，即动物模型在症状上与疾病症状的高度相似性；（2）造模方式所依据的理论与临床慢性应激障碍或慢性疲劳的病因之间具有高度相关性；（3）动物模型的病理生理特征与临床上接受CFS治疗的患者具有高度相似性；（4）模型动物的行为学改变能够持续足够长的时间。由于在临床上，CFS尚无特异性的检测方法及特异性诊断指标，因此对于CFS的相关研究多采用观察动物情绪及认知行为变化的一系列行为学检测方法来判断CFS动物模型成功与否，主要包括：鼠尾悬挂、十字迷宫及旷场测试等。当机体受到慢性应激刺激时，机体内环境稳态处于失衡状态，可引起相关行为学的改变，也能够由于应激状态下引起一系列血生化及神经损害，引起大脑的器质性损伤，进而影响动物的情绪及认知功能（海马受损会引起认知障碍），同时导致机体免疫力下降，引发疾病。

在模型检验方面，国内外研究在造模后多通过动物一般情况观察和进一步的动物实验了解动物体力情况，学习记忆情况、探究行为及情绪反应、糖水消耗实验等行为学指标等[37-39]，来判断动物造模是否成功；也有通过实验室指标（白细胞、红细胞、IgG、肝糖原、血清乳酸、血清尿素氮、血清CORT、ACTH）判断者[36]。国外针对疲劳模型的检测则更注重于一些行为学及生化指标的改变，比如在强制游泳实验中动物的不动时间、活动能力、焦虑样表现（高架十字迷宫和Mirror水迷宫）等直观的行为学改变，同时也包括血脂质过氧化反应、过氧化氢酶、亚硝酸酯等生化指标变化来判断是否成功建立了慢性应激性疲劳模型[40]。

5 总结

应激主要分为躯体和心理应激两种类型，但在真实的应激状态下，通常是两种应激类型共同作用的结果，只能将其描述为以哪一种类型的应激为主要影响因素[41]。研究发现，大部分CFS单因素造模只能通过某一方面模拟慢性疲劳的状态进行模型的构建。例如，单一的强制游泳法只能通过影响动物体力因素达到刺激效果而建立疲劳模型；慢性束缚模型则只能通过产生心理应激达到建模效果，均只能从某一方面模拟人类的疾病状态。过度的运动训练建立的疲劳模型只能从刺激躯体体力因素反映CFS的状态，心理应激模型则主要通过免疫体液系统来揭示应激产生的机制[42]。

同样地，CFS模型从刺激因素数量上又可分为单因素模型和复杂因素模型两种类型：单因素模型涵盖了强迫游泳、跑台等刺激源建立躯体应激模型，束缚、电刺激、夹尾等应激源构建心理应激模型；复杂因素模型主要建立的是不规定时间、频率的禁食、禁水、昼夜颠倒、夹尾、冰水游泳、束缚等慢性轻度不可预见性应激模型。各种建模方法各有优缺点，由于目前对于CFS的研究较少，且其发病机制及病理改变仍未明确，因此单一因素的动物模型很难模拟并完美地模拟慢性应激性疲劳的全部症状。近期的疲劳相关研究多采用多因素造模，通过构建两种或多种复杂应激源刺激联合对动物进行造模，同时兼顾了躯体应激和心理应激两个因素。近年来，针对CFS的动物模型建立方法一直在不停地靠近疾病生理病理改变机制，为对于CFS的机制研究方向及抗疲劳治疗方向均提供了可靠的实验依据。但在未来的研究中，仍需要考虑动物模型的建立方法与疾病相关性、疾病临床症状的模拟，从实验方法手段技术的统一性、规范性方面进行深入探究。