微塑料对浮游植物群落的影响研究

李宇佳，孙萍，张翔宇，徐宗军，王清爽，王宗灵

（1.长春理工大学 生命科学技术学院，长春 130022；2.自然资源部海洋生态环境科学与技术重点实验室 自然资源部第一海洋研究所，青岛 266061）

海洋浮游植物是海水中随波逐流的单细胞藻类，是海洋中最主要的初级生产者，为海洋生物提供了必要的生态学功能，同时在海洋碳循环中起着至关重要的作用［1］。随着塑料应用的迅速发展，造成海洋水体污染［2］。因此，关于海洋环境中微塑料对海洋浮游植物影响研究对于海洋环境保护有重要意义。

大量陆源、海源和大气污染物中的塑料，通过各种渠道进入海洋，导致海洋中微塑料含量增高，影响海洋浮游植物生长。因微塑料遮蔽效应，降低藻类光合作用效率，从而抑制微藻类生长［3］。微塑料和微藻的理化特性产生相互吸附，阻碍微藻光合作用并促进活性氧（ROS）的产生［4］，而且，吸附在微藻细胞表面的微塑料可能在表面包裹功能区，限制细胞与环境之间能量与物质交换或转移，阻碍营养物质、光、CO2和O2从培养基进入藻细胞内。有害藻代谢产物被锁定在细胞内扰乱藻细胞生长［5］。微藻培养物中微塑料的分布与微藻种类和生理状态有关［6］，对微藻的毒性与其粒径大小有关［7］，如小粒径（0.1 µm）聚苯乙烯可抑制小球藻的光合作用［8］。一般来说，微塑料粒径越小对微藻毒作用越显著，研究发现小粒径聚苯乙烯（0.05µm）可显著抑制杜氏盐藻生长，但当粒径增加至6µm时却无明显影响［9］。

基于上述研究成果，搭载向阳红18船于2020年11月在黄渤海执行科考期间完成微塑料对浮游植物群落影响海上实验。

1 材料与方法

1.1 培养装置与实验条件

向阳红18船在黄渤海执行“中国近海综合开放航次”任务中，现场采集表层海水进行培养，采样站点为黄海海域NSA-1站（121.5°E，36.5°N），水深25 m，表层海水温度为18.24℃，表层海水盐度为31.63。

将海水按照实验设计添加营养盐和微塑料进行培养，每个桶（培养瓶）为一个培养体系，如图1所示。

图1 海上现场培养实验照片

1.2 实验试剂与仪器设备

实验中添加3µm和0.3µm两种粒径聚苯乙烯（PS）微塑料。按f/2培养基配方添加营养盐，按照预先配制1 000倍储备液。用过滤海水分别配制储备液，高压灭菌器中120℃灭菌30 min备用。

实验过程中使用的仪器和设备如表1所示。

表1 实验所需仪器和设备表

1.3 实验设计与培养方式

在甲板上安装围隔装置，微塑料为带荧光标记的聚苯乙烯（PS），分为1个对照组和8个实验组。对照组只添加营养盐，实验组两个不同粒径微塑料添加浓度分别为1 mg/L、5 mg/L、20 mg/L及50 mg/L，如表2所示，添加f/2培养基储备液进行培养。每个对照组和实验组设三个重复，共27个培养瓶。

表2 海上现场培养实验微塑料添加浓度

1.4 取样参数与取样频次

浮游植物分为小型（20～200 µm）、微型（2～20µm）和微微型（＜2µm）。

取样参数：叶绿素a、分粒级叶绿素a、营养盐（硝酸盐、亚硝酸盐、铵盐、活性磷酸盐和活性硅酸盐）、微微型浮游植物、微型和小型浮游植物［10］。

取样频次：实验期间，初期每2天取样一次，第6天起每天取样，取样前将培养水桶混合均匀，分别取样并装入预先标记编号的取样瓶中。

1.5 样品采集与分析方法

1.5.1 叶绿素a样品采集与测定

叶绿素a样品的采集：从取样瓶中取100 mL培养后的海水，经200µm筛绢预过滤和GF/F玻璃纤维滤膜过滤，负压＜0.03 MPa，保存于超低温冰箱（-80℃）中。

叶绿素a浓度测定：采用萃取荧光法，按照《海洋调查规范 第6部分：海洋生物调查》（GB/T 12763.6-2007）（中国国家标准化管理委员会，2008b）进行测定。

1.5.2 分粒级叶绿素a样品采集与测定

分析测定细胞粒径分别为20～200µm、2～20µm以及0.7～2µm各组分的浮游植物藻对总叶绿素a的贡献。

从各培养瓶中取100 mL用200µm筛绢滤过的培养海水，依次用20µm筛绢、2µm核孔滤膜和玻璃纤维滤膜分级过滤，滤膜上截留的浮游植物即为各粒级组分，取样频次为实验培养起始（0 d）、生长旺盛期（5 d）及实验结束（8 d）时各取样1次。

叶绿素a各粒级组分含量及百分比计算：依次通过3个规格滤膜所截留的浮游植物测定结果即为各粒级组分，对滤膜进行叶绿素a萃取后测定结果即为叶绿素a各粒级组分含量，以mg/m3表示，三者分别占其累加值比例即为各粒级组分百分比。

1.5.3 营养盐样品采集与测定

叶绿素a样品采集时，将过滤后的海水分装到干净容器中，做好标记，放入-20℃冰箱冷冻保存，用以测定营养盐浓度变化。

基于分光光度法检测营养盐浓度。实验采用连续流动分析仪进行5项营养盐指标测定［11］，如表3所示。

表3 五项营养盐检测方法

1.5.4 微微型浮游植物样品采集与测定

样品采集：从各培养瓶中取少量培养海水，经20µm筛绢过滤后取4.5 mL置于5 mL冻存管，加入0.5 mL固定液（10%多聚甲醛+0.5%戊二醛）固定混匀避光常温静置10 min，充分反应后放入液氮速冻0.5 h，转至-80℃超低温冰箱保存。按培养起始（0 d）、生长旺盛期（5 d）及实验结束（8 d）各取样1次。

测定：采用流式细胞仪进行微微型浮游植物分类和计数，如图2所示。

图2 流式细胞仪测定微微型浮游植物双参数图

样品采集：各培养瓶中60 mL，装入干净塑料瓶中，加入浓度2%鲁哥氏碘液常温下避光保存，沉降24 h以上去除上清液，浓缩至一定体积后，用于镜检。

细胞丰度、物种组成、优势种测定：浮游植物的形态学物种鉴定和计数在荧光倒置显微镜下进行。浮游植物细胞丰度用单位水体内细胞数（cells/L）表示。

2 结果与分析

2.1 浮游植物各参数初始值

2.1.1 浮游植物叶绿素a及粒级结构

实验初始浮游植物叶绿素a的浓度平均值为0.68 mg/m3。经分粒级过滤后累加法计算的总叶绿素 a浓度平均为 1.018 mg/m3，0.7～2 µm、2～20µm及20～200µm粒级所占百分比平均值分别25.75%、39.71%及34.54%，如表4所示。

表4 对照组实验初始叶绿素a粒级结构统计表

2.1.2 微微型浮游植物丰度

微微型浮游植物测定结果包括微微型光合浮游植物和异养细菌。微微型光合浮游植物主要包括原绿球藻、聚球藻和微微型真核藻，测定结果如表5所示。

表5 对照组实验初始微微型浮游植物丰度统计表

2.1.3 微型和小型浮游植物种类组成与优势种

1.2.1 医务工作者职业幸福感调查问卷 该问卷由李桂华等[6]编制，包含5个维度24个条目：身心健康状况(6个条目)；价值/能力体现(6个条目)；社会支持(5个条目)；工作环境(4个条目)；经济收入(3个条目)。采用Likert 5级评分法：1分为完全不符合，2分为基本不符合，3分为不确定，4分为基本符合，5分为完全符合。总分120分，分数越高表示职业幸福感越强。

经显微镜下鉴定，实验初始时浮游植物物种组成如表6所示。共鉴定出浮游植物54种，包含38种硅藻、14种甲藻、2种金藻。

表6 培养初始浮游植物群落组成

培养初始时浮游植物优势种中以细胞粒径较大甲藻门类的三角角藻占总细胞丰度为23.2%，百分比最高，其次是硅藻门类的柔弱角毛藻和旋链角毛藻，总细胞丰度的百分比分别为15.9%和11.0%，如表7所示。

表7 培养初始优势种组成

2.2 培养实验过程中营养盐浓度的变化

对照组和实验组均添加f/2培养基，跟踪测定各培养体系中各营养盐浓度变化趋势，如图3、图4及图5所示。结果显示，营养盐的消耗与添加的微塑料粒径大小和浓度高低间并没有明显的差异性和规律性。但随着培养时间的增加，磷酸盐浓度逐渐降低，对磷酸盐消耗较为明显，而硝酸盐和硅酸盐仅在微塑料添加浓度为50 mg/L时呈明显下降趋势。

图3 各培养体系中硝酸盐浓度变化曲线

图4 各培养体系中磷酸盐浓度变化曲线

图5 各培养体系中硅酸盐浓度变化曲线

2.3 浮游植物叶绿素a及粒级结构的变化

2.3.1 叶绿素a的变化

培养实验前期，对照组和各实验组叶绿素含量的累积均不明显，第2天叶绿素a略有增加，第4天叶绿素a缓慢升高，6天起增长较快（图6和图7）。对照组三个重复培养瓶中叶绿素a浓度平均值在6天达到9.73 mg/m3，7天和8天分别升至16.00 mg/m3和17.31 mg/m3；与对照组相比，各处理组叶绿素a浓度在4天时开始出现差异，6～8天期间差异明显，且与微塑料粒径和浓度有关。

3µm聚苯乙烯添加实验结果：1 mg/L和5 mg/L较低浓度聚苯乙烯对浮游植物生长有较为明显的促进作用，叶绿素a浓度6天开始，相较于对照组迅速积累，至8天平均值高达34.33 mg/m3。20 mg/L和50 mg/L较高浓度聚苯乙烯对浮游植物生长有一定抑制作用，7天两个实验组的叶绿素a浓度分别为14.89 mg/m3和12.22 mg/m3，抑制不明显，至8天叶绿素a分别为17.21 mg/m3和17.97 mg/m3，该种抑制呈现削弱趋势，如图6所示。

图6 不同浓度梯度的3µm聚苯乙烯影响下叶绿素含量随时间的变化

0.3µm聚苯乙烯添加实验结果与3µm相比呈现明显不同规律，低浓度时没有促进作用，而小粒径聚苯乙烯对浮游植物生长抑制作用随着浓度增加而增加。微塑料浓度越高抑制作用越明显，如图7所示。

图7 不同浓度梯度的0.3µm聚苯乙烯影响下叶绿素含量随时间的变化

2.3.2 叶绿素a粒级结构的变化

在实验培养起始（0 d）、生长旺盛期（5 d）及实验结束（8 d）时均进行了分粒级叶绿素a测定，对照组和各实验组各粒级叶绿素a浓度统计如表8所示，不同培养期浮游植物各粒级叶绿素a浓度柱形图（图8和图10）和百分比堆积柱形图（图9和图11）。不同实验组各粒级叶绿素a浓度变化与微塑料粒径大小和添加浓度均有关。

表8 对照组和实验组培养过程中不同粒级叶绿素a浓度的统计表

图8 3µm聚苯乙烯实验组浮游植物各粒级叶绿素a浓度柱形图

图9 3µm聚苯乙烯实验组浮游植物各粒级叶绿素a百分比堆积柱形图

图10 0.3µm聚苯乙烯实验组浮游植物各粒级叶绿素a浓度柱形图

图11 0.3µm聚苯乙烯实验组浮游植物各粒级叶绿素a百分比堆积柱形图

上述研究表明，营养盐加富情况下，在对照组中各粒径浮游植物生长均有促进作用，更利于2～20µm粒级微型浮游植物生长。较大粒径（3µm）聚苯乙烯在低浓度（1 mg/L和5 mg/L）时可促进浮游植物生长，其次是20～200µm小型浮游植物。而对0.7～2µm微微型浮游植物影响不大；较大粒径（3µm）聚苯乙烯在高浓度（20 mg/L和50 mg/L）时抑制浮游植物生长，2～20µm微型浮游植物和20～200µm小型浮游植物抑制作用明显，但随着培养天数延长抑制作用减弱；较小粒径（0.3µm）聚苯乙烯对浮游植物生长抑制作用随着浓度增加而增加，但培养天数延长，低浓度下（1 mg/L和5 mg/L）抑制作用减弱；较高浓度下（20 mg/L和50 mg/L）抑制作用越发明显。

2.4 微微型浮游植物的变化

在实验培养起始（0 d）、生长旺盛期（5 d）及实验结束（8 d）时采用流式细胞仪法进行了微微型浮游植物测定，对照组和各实验组各类群微微型浮游植物丰度和细菌数量统计如表9所示。

表9 对照组和各实验组各类群微微型光合浮游植物丰度和细菌数量统计表/（103cells/cm3）

对照组初始微微型光合浮游植物以原绿球藻（Pro）为主［12］，营养盐加富条件下，Pro丰度略有降低，聚球藻（Syn）和微微型真核藻（PEuk）生长较为明显，8 d其丰度分别为31.61×103cells/cm3和 82.96×103cells/cm3。

直径为3µm和0.3µm聚苯乙烯添加实验结果：PEuk受到影响相对较小；Syn生长均受到了明显抑制作用，且随浓度增加抑制作用明显加强；Pro在5 d时受到明显抑制，而8 d时各实验组Pro丰度均超过了对照组，表明抑制作用随培养天数增加消失，甚至进而转变为促进，如图12和图13所示。

图12 3µm聚苯乙烯添加实验中微微型光合浮游植物丰度堆积柱形图

图13 0.3µm聚苯乙烯添加实验中微微型光合浮游植物丰度堆积柱形图

采用流式细胞仪法测定的细菌数量结果显示，浮游植物生长受到抑制的实验组细菌数量较对照组高，而生长受到促进的实验组细菌数量较对照组低，如图14和图15所示。

图14 3µm聚苯乙烯添加实验中细菌数量柱形图（流式细胞仪法）

图15 0.3µm聚苯乙烯添加实验中细菌数量柱形图（流式细胞仪法）

2.5 微型和小型浮游植物优势种

在实验培养起始（0 d）、生长旺盛期（5 d）及实验结束（8 d）时采集浮游植物种类分析鉴定样品，显微鉴定分析结果统计如表10所示。与初始值相比，经过5 d和8 d时间的培养，对照组和各实验组甲藻类均不再成为优势种；优势种全部为硅藻，且以柔弱角毛藻、旋链角毛藻、扁面角毛藻为主，在8 d时部分实验组中尖刺伪菱形藻可成为前二优势种。优势种组成及其所占比例的变化同聚苯乙烯微塑料粒径大小和添加浓度均无明显关联性。

表10 培养实验不同时期浮游植优势种统计表

3 结论

通过实地采集并培养了黄海海域表层海水中自然浮游植物群落，开展了不同浓度（1 mg/L、5 mg/L、20 mg/L和50 mg/L）、不同粒径（3µm和0.3µm）聚苯乙烯微塑料对微微型、微型和小型浮游植物优势种生物量（叶绿素a）及其粒级结构（分粒级叶绿素a）的影响研究。结果表明：聚苯乙烯粒径越小，浓度越高，对浮游植物群落生长抑制作用越明显；粒径相对较大（3µm）聚苯乙烯在低浓度（1 mg/L和5 mg/L）时一定程度上促进其生长；2～20µm微型和20～200µm小型浮游植物，更易受到微塑料添加的影响；而0.7～2µm微型浮游植物中真核藻受到微塑料添加的影响相对较小。例如，聚球藻生长受到抑制作用明显，且随浓度增加而加强；原绿球藻抑制作用随培养天数增进而转变为促进作用。