Klotho在缺血性脑卒中患者血清中的表达及临床意义

毕芳芳 史敏 苏明权 程微微 张露

世界范围内，每年有近1 500 万人罹患卒中，近600 万人死于该病，近50 万人遗留终身残疾，其已成为继痴呆后致残的第二位因素［1］。缺血性脑卒中（cerebral ischemic stroke，CIS），也称脑栓塞，指由于脑的供血动脉狭窄或闭塞、供血不足导致的脑组织坏死的总称。根据研究发现，缺血性脑卒中大约占临床上卒中疾病总数的60%～80%，可反复发作，有一定的致残率和致死率，而幸存者往往遗留不同程度的神经功能障碍，其突发性、严重性和不可预测性给患者和家属带来了严重的生理和心理负担［2］。因此相关机制和治疗策略的研究一直是神经科学领域的焦点。本研究前期研究显示：氧化应激与炎症过度反应可能是CIS 疾病进展中的重要因素之一［3］。近年有研究发现Klotho 水平的下降与炎症反应，细胞死亡有关［4］。另有动物实验证明，血清中Klotho水平的下降［5］。上述研究共同表明：Klotho在血清中起着至关重要的作用。但Klotho在CIS 患者中的具体表达及其与CIS 患者疾病活动度的关系，目前尚未见报道。本研究分析其与CIS 患者疾病活动度的相关性，为CIS 的诊疗及CIS 机制的研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 CIS 患者标本的收集

选取2020年4月至2022年4月西安市西京医院收治的52 例CIS 患者作为研究对象。纳入标准：①年龄60～85 岁；②确诊为缺血性脑卒中；③自愿受试。排除标准：①出血性脑卒中；②精神病；③依从性差。所有患者及其家属均对本研究充分知情，并已经签署知情同意书，本研究经西安培华学院医学院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂及仪器

RNA 提取试剂盒（DP400，天根，西安）；GAPDH抗体（Santa Cruz Biotechnology，美国），Klotho 抗体（Sigma-Aldrich，美国）。Viia 7 实时定量PCR 仪（ABI Viia 7，美国）。Klotho 及内参引物均由上海生工生物公司合成；Klotho上游引物：5′-TAGCC AGCGA CAGCT ACAAC-3′，下游引物：5′-GAAGC GGTAG TGAGT GACCC-3′，GAPDH 上游引物：5′-CTCTG CTCCT CCTGT TCGAC-3′，GAPDH下游引物：5′-TAGCC TCCCG GGTTT CTCTC-3′。

1.3 RT-qPCR

根据说明书提取总的RNA，并检测其浓度和纯度，RNA 纯度A260/280 在1.8～2.1 之间认为合格。逆转录条件：5℃10 min，50℃30 min，85℃5 min。qPCR 反应：预变性95℃，5 min；循环反应95℃，5 s，58℃，30 s，72℃，30 s，循环次数，35；彻底延伸：72℃10 min。每个样本3 个复孔。采用2-ΔΔCt法计算Klotho 的相对表达量。

1.4 Western Blotting

提取组织总蛋白，按照BCA 蛋白测定试剂盒说明书进行浓度检测，分装后保存于-80℃冰箱备用。按照所测蛋白浓度，计算含40 μg 蛋白的体积即为上样量，99℃加热5 min 后冷却上样；60 V 等压电泳50 min 后转为110 V 继续电泳1.5 h 至溴酚兰到达分离胶的底部；电泳结束后，取出凝胶，放置在1×Transfer buffer 中平衡15 min。按照白板-滤纸-PVDF 膜（使用前在甲醇中活化5 min）-凝胶-滤纸-黑板的顺序置于夹子中，加入预冷的1×Transfer buffer，100 V、90 min；转完膜后，将PVDF膜取出，放在5%脱脂牛奶中封闭2 h，用1×TBST洗涤一次；将目的条带，放在相应的一抗抗体（使用前按照说明书推荐比例用1×TBST 稀释）中4℃摇床孵育过夜。第二天，目的条带在1×TBST 中洗3 次，每次10 min，再放入相应的二抗抗体中（使用前按照说明书推荐比例用5%脱脂牛奶稀释），常温摇床孵育1 h，再在1×TBST 中洗3 次，每次10 min；最后化学发光、显影。结果分析：FluorchemTM8900图像分析软件定量分析靶蛋白及内参GAPDH条带的含量，求其比值进行统计分析。

1.5 统计学分析

采用SPSS 16.0 统计软件进行分析；计量资料用（）表示，组间比较采用独立样本t检验；用非参数相关的Spearman 轶相关系数（r）分析评估两个变量之间的相关性。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Klotho 的mRNA 表达结果

Klotho的mRNA 水平在CIS 患者血清标本中的相对表达量为（1.83±0.23），低于正常对照组（3.34±0.56），差异有统计学意义（t=17.986，P＜0.05）。见图1。

图1 Klotho mRNA 在CIS 患者及正常对照组表达Figure 1 mRNA Expression of Klotho in CIS patients and the normal controls

2.2 Klotho 的蛋白表达结果

Klotho的蛋白水平在CIS患者血清标本中的表达量为（141.78±69.04），低于正常对照组（375.82±83.71），差异有统计学意义（t=15.554，P＜0.05）。见图2。

图2 Klotho 蛋白在CIS 患者及正常对照组表达Figure 2 Protein Expression of Klotho in CIS patients and the normal controls

2.3 Klotho 的表达与CIS 患者疾病活动度的相关性分析

CIS 患者血清样本中Klotho的表达与其疾病活动度评估指标NIHSS 评分及Barthel 指数（BI）评分具有一定的相关性。见图3。

图3 Klotho 的表达与CIS 患者疾病活动度的相关性分析Figure 3 Correlation analysis between the expression of Klotho and disease activity in patients with CIS

3 讨论

CIS 也称脑栓塞，是脑动脉狭窄或阻塞、脑供血不足导致的脑组织坏死的脑缺血类型的总称，为临床常见的脑血管疾病之一［1］。脑缺血性损伤的机制涉及许多病理生理过程，越来越多的研究认为，其发病原因与炎症、氧化应激、细胞凋亡、细胞焦亡等均有一定的相关性［6］。其中，炎症级联反应所导致的细胞凋亡和焦亡是CIS 发病的核心环节。因此，抑制机体内源性炎症级联反应是CIS 治疗的关键所在。流行病学研究显示：CIS 在中国仍呈逐年增高的趋势［7-8］，己成为神经科学研究的热点和难点之一。因此，进一步阐明CIS 发病相关机制和治疗策略，是一项十分重要且扼待解决的任务，具有重要的临床价值及意义。

在生命发育与健康维持过程中，Klotho基因通过调控离子通道、Wnt等多个信号通路和靶基因的表达发挥抗衰老、肾脏保护、心血管保护、抗肿瘤和调节代谢等作用［9-10］。Klotho基因是Kuro-o 等科学者在1997年研究自发性高血压时偶然发现的［13］，后来研究发现Klotho基因缺失鼠（Kl-/-）的表型类似人类的衰老表现，包括寿命缩短、动脉硬化、皮肤肌肉萎缩、认知障碍、运动神经元受损、软组织钙化、听力下降、骨质疏松等。然而，当Klotho蛋白过表达时，实验动物的寿命可得以延长，表明了它是一个衰老抑制基因；当Klotho蛋白表达异常时，会出现一系列与衰老及与衰老密切相关的疾病，提示Klotho基因在衰老和衰老相关疾病的发生中起着重要作用。Klotho基因首先从表现为衰老的模型小鼠中克隆成功［11］。随后发现人和大鼠中也存在Klotho基因，且它们之间具有较高的同源性（83%）。Klotho基因全长50 kb，包含5 个外显子和4 个内含子，在人和小鼠中均定位于第13 号染色体（13q12）。在其基因结构中，其RNA 可通过选择性拼接产生两种蛋白产物，一种为包括5 个外显子和4 个内含子，编码形成的膜型Klotho蛋白；一种为仅含3 个外显子和2 个内含子而编码形成的分泌型Klotho蛋白，分泌型的还有一种是直接从膜型Klotho蛋白的胞外域脱离下来的。人的分泌型Klotho蛋白全长有549 个氨基酸残基（小鼠为550个），该类型缺乏跨膜结构和胞内结构，在人的大脑、海马、胎盘、肾脏、前列腺和小肠等组织中均检测到其存在，在血清中也检测到Klotho蛋白的存在［12］。分泌型Klotho可通过中断细胞内控制氧化应激、纤维增生、炎症、细胞衰老等局部或全身性病理过程的关键细胞信号分子起到保护作用。研究表明，Klotho可靶向肾小管细胞中的线粒体功能障碍和细胞衰老来延缓肾纤维，且进一步研究发现Klotho是通过抑制胰岛素下游IRS-1/PI3K/AKT 信号通路从而缓解肾脏的纤维化［13］；此外，也有研究报道Klotho是通过抑制细胞坏死和氧化应激从而减轻血管紧张素II 引起的心脏毒性；对于中风的研究，有研究报道Klotho在血清中的浓度可预测急性缺血性中风患者三个月后的功能结局［14］，进一步有研究发现Klotho协助FGF21受体FGFR1通过激活PI3K/Akt信号通路来促进对于新生鼠缺氧缺血性脑损伤后的功能恢复［15］；四川大学华西药学院研究团队发现Klotho 增加了脑内锰超氧化物歧化酶（Mn-containing superoxide dismutase，Mn-SOD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）的表达，减少了脑内丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，同时Klotho 过表达抑制了Akt 和FoxO1 的磷酸化［15］，研究提示Klotho 可能通过Akt/FoxO1 信号通路在CIS 的发生发展中发挥着重要的作用，但具体的作用机制仍然需要进一步探究。以上结果均强烈提示，Klotho很可能在CIS 的发生发展中起到重要的作用。

本研究提示Klotho 可能在CIS 的发病中扮演着十分重要的角色，为CIS 发病机制的相关研究提供了新的方向和靶点。但Klotho 在CIS 发病中的具体的作用机制仍然需要进一步的研究。