牙龈组织中MMP-13和TIMP-1的表达与游离龈移植术后应用CGF生长因子创面愈合的关系

于兰 于文凤 吕敏敏

游离龈移植术是指将用自体健康的牙龈组织移植到角化龈缺失或不足区域，加宽附着龈，加深前庭沟，目前广泛用于牙周手术中［1］。但游离龈移植后，供区会出现一个开放的伤口，该伤口一般需要2～4周才能完全恢复，继发性创伤会影响患者的术后舒适度，严重时供区发生感染，造成伤口愈合时间延长［2］。血小板浓缩液能释放多种生长因子，释放的生长因子可用于促进伤口愈合和减轻术后疼痛和不适。浓缩血小板生长因子（concentrated growth factors，CGF）是第三代血小板衍生物，相关研究表明，CGF 释放的多种生长因子可用于促进骨和软组织的形成，对伤口愈合具有促进作用［3］。基质金属蛋白酶（matrix mettallo-proteinases，MMPs）是一种主要由结缔组织细胞分泌的蛋白酶，能破坏细胞外基质，并参与多种生物作用，如重塑组织、创伤愈合等，其中，基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13）和组织金属蛋白酶抑制剂1（Tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）是MMPs 家属成员之一。以往研究以证实MMPs 在伤口愈合的过程中发挥着积极作用［4］，但MMP-13 和TIMP-1 游离龈移植术后应用CGF 生长因子创面愈合过程中的表达尚不清楚。因此，本研究旨在探讨牙龈组织中MMP-13 和TIMP-1 的表达以及游离龈移植术后应用CGF 生长因子创面愈合的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2019年6月至2021年12月沧州人民医院口腔科行游离龈移植术的患者82 例作为研究对象。纳入标准：①行游离龈移植术者；②年龄＞18岁；③配合度良好；④3 个月内未服用抗生素；⑤所有患者均签署知情同意书。排除标准：①合并有恶性肿瘤、严重基础疾病、严重的心、肝、肾功能不全的者；②有血液或免疫系统基本者；③3 个月内有服用干扰软组织再生的相关药物；④存在牙周手术禁忌症。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法

两组患者均行游离龈移植术后，对照组获得游离龈瓣后，在供体处缝合碘仿纱条，观察组应用CGF 薄膜覆盖硬腭供区创面，再用碘仿纱条缝合。

1.2.2 标本提取

于治疗后3、7、14、30 d 后局部麻醉后沿牙龈近中、远中垂直切入牙周袋或龈沟底部，再沿袋底或沟底横向切开以获取牙龈组织标本。放置在40 g/L 多聚甲醛中进行2～12 h 的固定。

1.2.3 免疫组化方法

固定标本脱水，透明，石蜡包埋，3 μm 厚切片，60℃烤箱烘烤2 h，经梯度乙醇脱水，pH 为9.0 的Tris-EDTA（pH 为9.0）微波复液修补15 min。在3%的H2O2室温孵育10 min。滴加按1∶250 稀释得一抗，在4℃下培养1 晚。非生物素二抗IgG 在37℃下培养15 min。每个步骤均用pH 为7.4 的冲洗3 次，每次冲洗时间为5 min。DAB 染色、苏木素复染、盐酸乙醇分化、脱水、透明、中性胶封片。PBS 替代一抗作为阴性对照。在400 倍光镜下，随机选取10 个视场进行拍摄，利用Image Pplus 图像分析测试软件对图像进行分析，并对其进行光度平均值的计算。

1.2.4 免疫组化阳性判断及数据统计

牙龈组织中MMP-13、TIMP-1 均以胞质内呈现棕黄色颗粒为阳性。采用半定量的积分法［5］，对10 个含有阳性细胞高倍镜视野（×200）进行随机观察，两名病理科医生进行双盲法读片，并对所观察到的阳性细胞的数量取其平均值进行计数。阳性：MMP-13、TIMP-1 的阳性细胞率为1%～10%，赋予1 分；11%～50%，赋予2 分；51%～75%，赋予3 分，强阳性：阳性细胞率为＞75%；阴性：MMP-13、TIMP-1 的阳性细胞率为0 或高倍镜视野下细胞质内未见棕黄色颗粒。低表达：阳性细胞率≤3 分，高表达：＞3 分。

1.3 观察指标

1.3.1 创面愈合率［6］

治疗后3、7、14、30 d 后用单反相机记录创面愈合情况。以一定的标准长度（参考牙周探针）和单反相机镜片垂直于组织创面的条件下进行创面拍摄，应用ImagePlus6.0 软件进行面积测量。创面愈合率=（初始创面面积-未愈合创面面积）/初始创面面积×100%。

1.3.2 实验室指标

治疗后3、7、14、30 d 后比较两组牙龈组织中MMP-13 和TIMP-1 的表达情况。比较观察组MMP-13 和TIMP-1 水平表达情况与创面愈合的关系。相关性分析观察组治疗30 d 创面面积愈合率与牙龈组织中TIMP-1 的关系。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计学软件进行数据分析。计量资料以（）表述，行t检验，计数资料以n（%）表述，采用χ2检验，用Pearson 相关性分析MMP-13和TIMP-1 与创面愈合的关系。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组创面愈合率比较

随治疗时间的延长，观察组的创面面积愈合率逐渐升高，观察组高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组创面愈合率比较（±s）Table 1 Comparison of wound healing rates between the two groups（±s）

表1 两组创面愈合率比较（±s）Table 1 Comparison of wound healing rates between the two groups（±s）

组别观察组对照组t 值P 值n 41 41 3 d 2.60±0.48 2.20±0.60 3.316 0.002 7 d 34.02±4.87 30.24±4.06 3.817 0.000 14 d 48.90±7.15 44.79±10.18 2.115 0.037 30 d 62.09±10.65 55.72±8.93 2.934 0.004

2.2 两组MMP-13 表达情况比较

随治疗时间的延长，观察组牙龈组织中MMP-13 的表达水平逐渐下降，观察组低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2、图1。

表2 两组MMP-13 表达情况比较（±s）Table 2 Comparison of MMP-13 expression between the two groups（±s）

表2 两组MMP-13 表达情况比较（±s）Table 2 Comparison of MMP-13 expression between the two groups（±s）

组别观察组对照组t 值P 值n 41 41 3 d 0.72±0.03 0.74±0.04 2.561 0.012 7 d 0.67±0.03 0.69±0.05 2.196 0.031 14 d 0.54±0.05 0.59±0.04 5.000 0.000 30 d 0.50±0.03 0.53±0.02 5.327 0.000

2.3 两组TIMP-1 表达情况比较

随治疗时间的延长，观察组牙龈组织中TIMP-1的表达水平逐渐上升，观察组高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3、图1。

图1 2 组牙龈组织中TIMP-1、MMP-13 的表达（SP，×400）Figure 1 Expression of TIMP-1 and MMP-13 in gingival tissue of two groups（SP，×400）

表3 两组TIMP-1 表达情况比较（±s）Table 3 Comparison of TIMP-1 expression between the two groups（±s）

表3 两组TIMP-1 表达情况比较（±s）Table 3 Comparison of TIMP-1 expression between the two groups（±s）

组别观察组对照组t 值P 值n 41 41 3 d 0.49±0.03 0.47±0.04 2.561 0.012 7 d 0.56±0.12 0.50±0.13 2.171 0.032 14 d 0.69±0.18 0.60±0.20 2.141 0.035 30 d 0.77±0.17 0.59±0.13 5.385 0.000

2.4 观察组MMP-13 和TIMP-1 水平表达情况与创面愈合的关系

MMP-13 的高表达组创面愈合率显著低于低表达组，差异有统计学意义（P＜0.05）。TIMP-1 的高表达组创面愈合率显著高于低表达组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 观察组MMP-13 和TIMP-1 水平表达情况与创面愈合的关系［n（%），（±s）］Table 4 The relationship between the expression of MMP-13 and TIMP-1 in observation group and wound healing［n（%），（±s）］

表4 观察组MMP-13 和TIMP-1 水平表达情况与创面愈合的关系［n（%），（±s）］Table 4 The relationship between the expression of MMP-13 and TIMP-1 in observation group and wound healing［n（%），（±s）］

项目MMP-13高表达（n=26）低表达（n=15）t 值P 值TIMP-1高表达（n=14）低表达（n=27）t 值P 值创面愈合率60.08±8.34 65.79±7.16 2.218 0.032 67.80±8.78 61.15±7.75 2.490 0.017

2.5 观察组治疗30 d 创面面积愈合率与牙龈组织中MMP-13、TIMP-1 的相关性分析

Pearson 相关性分析结果显示，观察组治疗30 d创面面积愈合率与牙龈组织中MMP-13 表达水平呈负相关（r=-0.031，P=0.035），与牙龈组织中TIMP-1表达水平呈正相关（r=0.403，P=0.009）。见图2。

图2 观察组治疗30 d 创面面积愈合率与牙龈组织中MMP-13、TIMP-1 的相关性分析Figure 2 Correlation analysis between wound healing rate and MMP-13、TIMP-1 in gingival tissue in the observation group after 30 days of treatment

3 讨论

修复各种由外伤或医源性引起的软组织缺损，是临床上普遍存在的问题。伤口的愈合是一个复杂的过程，需要各种胶原、可溶性介质、细胞因子、炎症细胞等多种因素的综合作用。目前，FGG术后腭部供区粘膜创面修复的方法较多，如血小板浓缩物等血液制品中丰富的生长因子，可以促进创面愈合。相关研究表明，浓缩生长因子能促进人牙龈成纤维细胞的增殖和分化，并促进种植体软组织的再生，对口腔种植体骨组织的起修复作用［7］。基质金属蛋白酶与基质金属蛋白酶抑制剂的动态平衡在修复组织细胞、炎性细胞迁移、促进创面上皮化等方面也发挥着关键作用，其中，MMP-13、TIMP-1均属于MMPs 家族［8］7。但MMP-13、TIMP-1 与游离龈移植术后应用CGF 治疗创面愈合中具体机制仍不清楚，需要深入探究其在牙龈组织中表达情况，分析其与创面愈合的关系。

血小板浓缩物由自提全血离心所得，CGF 是第三代血小板衍生物，与富血小板血浆、富血小板纤维蛋白相比，CGF 中含有更丰富的生长因子，具有较强的细胞增殖和修复作用。本研究结果显示，随治疗时间的延长，观察组的创面面积愈合率逐渐升高，观察组高于对照组。由于CGF 中的生长因子较为丰富，治疗时间越长，观察组表现出较对照组更好的创面愈合效果。CGF 中富含纤维蛋白支架、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子以及表皮生长因子等，这些生长因子对上皮细胞的增殖有明显的促进作用，并能在创面中形成新的血管网络，从而保证硬腭供区的营养供给［9］。此外，CGF 膜中丰富的生长因子，能够满足机体早期修复所需，且与细胞间存在良好的协同效应，弥补了单一生长因子对组织修复的影响，加快缺损区的修复。本研究结果显示，随治疗时间的延长，MMP-13 的表达水平逐渐下降，观察组低于对照组。慢性难愈合创面是由于过多的炎性因子作用所致，早期可见到少量MMP-13 及TIMP-1 的表达，到晚期时，由于大量的炎症因子存在，导致机体内MMP-13 和TIMP-1 被释放，破坏创面的正常组织，导致机体形成久不愈合的状况［10-11］。MMP-13是多种炎症因子最后作用的靶分子，TIMP-1 参与炎症细胞浸润和转移的过程，本研究创面愈合的其作用机理考虑是通过降低MMP-13、TIMP-1 的表达水平相关［12-13］。MMP-13、TIMP-1 在上皮细胞再生及伤口愈合中具有重要作用。本研究结果显示，MMP-13 高表达组创面愈合率均低于低表达组，TIMP-1 高表达组创面愈合率均高于低表达组。MMP-13 参与多种正常的生理、病理过程，如组织愈合、形态形成和修复，当创面愈合程度越高，MMP-13 表达水平越低［14］。TIMP-1 的高水平表达可能通过对MMPs 的清除、细胞的迁移以及细胞外基质的降解等作用，从而起到促进伤口的愈合效果［15］。本研究Pearson 相关性分析显示，观察组术后30d 创面面积愈合率与牙龈组织中MMP-13表达水平呈负相关，与TIMP-1 表达水平呈正相关。因此，术后通过监测患者牙龈组织中MMP-13、TIMP-1 表达情况，而给予针对性的治疗，及时纠正游离龈移植术后供区创面的微环境，可促进创面的愈合。

综上所述，行游离龈移植术后应用CGF 生长因子治疗患者牙龈组织中MMP-13 的表达水平逐渐下降，TIMP-1 的表达水平逐渐逐渐升高，两者与创面愈合率密切关联，CGF 生长因子可能通过调控MMP-13 和TIMP-1 之间的关系以达到促进创面愈合的目的。