基于创新能力培养的荧光显微镜系统综合实验设计

陈小钢， 黄幼萍， 庄江峰， 林彩固， 张 昊， 余运龙

（福建江夏学院a.电子信息科学学院；b.数字福建物联网智能家居信息采集与处理实验室，福州 350108）

0 引 言

创新是当代大学生应当具备的重要素质，是社会发展、国家兴盛的重要保障［1］。培养具有创新素质的人才是时代的迫切需求，而高校教育作为高素质创新人才培养的重要基地，应当把教学改革的重点着眼于创新型人才培养，这是一项关系全局的系统工程［2-3］。综合性实验是学生综合运用多门课程内容、技能和方法完成相关考验，是集分析、设计、实践于一体的复合型实验［4-6］。对比于一般的演示性和验证性实验，综合性实验要求学生在具备一定的知识和技能储备的基础上进行更深入的思考与实践，是培养学生科学素养和创新能力的重要途径。传统工程光学实验内容主要以演示性和验证性实验为主，学生没有自主选择、设计实验的机会，不利于学生科研能力和创新意识的培养［7-10］。因此，在工程光学实验内容中设计更多的综合性实验对培养光电专业学生创新素质具有重要的现实意义。

显微镜作为一种典型的光学系统，被广泛运用于生物成像、医学检测、材料表征等领域［11-15］。不同于普通光学显微镜，荧光显微镜成像技术具有：①高对比度和分辨率，图像信噪比高，能够获得更多样品细节信息；②高度特异性与灵敏性，能够实现微量物质的量化和进行多标记功能成像；③部分低毒的荧光染料能够实现活体染色和成像研究等优点。目前实验室中的荧光显微镜一般购置商业显微镜，如奥林巴斯（Olympus）、尼康（Nikon）、徕卡（Leica）、蔡司（Zeiss）等进口品牌。一方面，商业荧光显微镜价格昂贵，增加了实验的经济负担。另一方面，商业荧光显微镜一般将光源、激发模块、采集模块集合在一起，并做了光路封闭处理，不方便对仪器按实验需求进行改造和加装模块。此外，在教学上，商业封闭式的显微镜也不利于教学使用，学生对荧光显微镜仅有概念上的认识，缺乏对各部分的实物认知。为了提高课堂教学效果，促进学生将光学理论与光学仪器设计有机融合，进一步将前沿学术热点融入课堂教学中，本文基于工程光学基本理论设计了自制荧光显微镜的研究型综合实验。学生通过分析、设计并完成开放式荧光显微镜系统的搭建，既能加深对工程光学理论知识的理解，同时满足科学实验需求，进一步开展科学研究。总之，通过理论与实践相结合，不仅可以有效培养学生学习兴趣，提升学生理论分析能力和实践动手能力，而且能进一步激发学生对科研的热情与探索欲，培养学生的创新精神，引领学生积极参与学科竞赛和创新项目申报。

1 荧光显微镜系统设计思路

一般光学显微镜的结构如图1（a）所示，其主体部分包括前端的物镜和后端的目镜组成。物体经显微镜物镜和目镜进行二次放大成像，最终实现对微小物体的高倍放大，使人眼能观察到物体的细节［16］。荧光显微镜主要是在传统显微镜的基础上进行改进，其结构可按图1（b）所示进行设计。图中，该结构一方面引入激发光源用于荧光激发，一般荧光光源有：特定波长的激光光源或者汞灯等宽波长光源；另一方面需要配置荧光发射、收集滤色片，用于对激发波长的选择、荧光信号的过滤和收集。

2 开放式荧光显微镜系统光路搭建

实验从大恒光电、基座光学购置所需光学元件用于自主搭建荧光显微镜系统。主要光学元件包括平凸透镜、可调光阑、衰减片、滤色片、LED白光灯源、物镜、套筒、支架等，其光路结构示意图如图2（a）所示。整个系统可以分为激光扩束系统、光路抬升系统、白光照明系统、筒镜匹配、双光路分光系统等部分，并可进行调节。

（1）激光扩束系统。为了能实现更好的荧光激发成像效果，系统采用固体激光器作为激发光源。激光出来首先经过一个可调衰减片，实现对光功率的可调控制。由于激光输出光束直径较小且带有一定发散角，因此激发前需要对激光光束进行扩束与准直。根据几何光学望远镜系统相关知识，采用两块平凸透镜来搭建一个望远镜系统，用于激光束的扩束。透镜焦距比为1∶3（f1∶f2＝50∶150），可实现对激光束3倍扩束。另外需要注意的是，为了更好地防止激光光束经其他镜面反射回谐振腔，影响激光稳定性，平凸透镜可按图2（a）中激光扩束系统所示方向摆放（平面朝外）。此外，在两透镜中间焦点附近加入一个光阑（等效针孔），可以进一步消除激光的强度噪声，得到更高质量激光束。

（2）光路抬升系统。本次搭建显微镜属于正置型显微镜，由于激光器置于光学平台上，其输出光束高度较低，为了将其耦合入物镜，需对激光光束进行抬升。实验利用一对成45°放置的反射镜构成一个潜望抬升系统，用于实现光路的水平抬升，如图2（a）中光路抬升系统所示。另外，两个反射镜均置于二维调节镜架上，通过调节其左右和俯仰角度，配合两个光阑（也可以用一个光阑进行前后移动），可以调节激光光束的水平输出，满足与其他元件之间的等高共轴调节。调节过程中应注意沿光路方向第一个透镜调节光斑在第一个光阑的位置（靠近透镜的位置），第二个透镜调节光斑在远端第二个光阑上的位置，当光斑同时落在前后两个光阑中心位置时，此时光路实现对准。

（3）白光照明系统。在光学显微镜中，由于观察物体一般不发光，因此需要借助外部光源进行照明。为了方便对样品的观察，所搭建的显微系统除了激光激发光源外，还加入了一路白光照明。在设计显微镜照明系统光路时，最直接方法就是将光源直接聚焦于样品上，即临界照明方式。其优点在于光能利用率高，有助于提高分辨率。不足之处在于，此时相当于将光源置于样品面上，因此光源像会出现在最终的成像面上，影响显微镜的观察效果。此外，这种照明方式没办法控制样品照明区域。改进的方法就是采用科勒照明方式，将光源远离样品平面，这样能够避免光源出现在成像面，同时实现较高的光能利用率和较大且可调的照明角度，非常适合显微系统照明使用。因此，在搭建过程中，以白光灯源、透镜、物镜和两个光阑构成科勒照明系统，其光路如图2（a）所示。

（4）筒镜匹配原则。当观察者使用目镜观察时，显微镜系统的放大倍率由物镜与目镜两者的放大倍率共同决定，即：

式中：Γ为显微镜系统整体的放大率；Γobj为物镜的放大率；Γeye为目镜放大率。

对于利用外接CCD进行成像时，显微物镜的实际放大率还与相机的套筒透镜的焦距有关。当采用不同显微镜制造商的物镜进行成像时，其物镜有效放大率为：

式中：Γeff为显微物镜的有效放大率；Γobj为印在物镜上的放大率；fsystem为所用显微镜系统中套筒透镜的焦距；fdesign为物镜制造商用来计算设计放大倍率所用套筒透镜的焦距，如徕卡、尼康、三丰等物镜制造商所设计的套筒透镜焦距为200 mm，而奥林巴斯物镜套筒焦距为180 mm，蔡司物镜为165 mm。通过计算物镜的有效放大倍率之后，便可得出系统的整体放大倍率。因此，为了方便计算系统放大率，筒镜焦距采用与物镜设计的套筒焦距一致，即奥林巴斯物镜需要匹配焦距为180 mm的筒镜，此时系统放大倍率即物镜上的放大倍数。

（5）双光路分光系统。荧光显微镜系统需要对收集光波段进行选择，因此需要搭配滤色片组使用。一套滤色片组由入射光滤色片、二向色镜和出射滤色片组成。首先激发滤色片选取需要的激发波长，通过二向色镜发射到样品上，样品发射的荧光先通过二向色镜和发射滤色片最后进入显微镜的采集模块。在搭建的显微系统中，激发光波长由激光器发出的波长决定，因此不需要采用激发滤色片。在物镜前设置一个45°放置的长波通二向色镜，这样就可以将波长较短的激发激光反射进物镜。激发的荧光通过二向色镜透射进入到采集光路中。此外，由于搭建的荧光显微镜系统能同时进行CCD成像与光谱双路采集，因此在终端需要加入一个半透半反镜进行分光，分光比1∶1。

3 荧光显微镜系统性能测试

实验所搭建的开放式荧光显微镜系统实物如图2（b）所示，接下来对荧光显微镜系统进行性能测试。

3.1 系统分辨率测试

在光学显微镜成像中，当两个物点靠得很近时，经过光学系统成像后形成的衍射光斑存在重叠的情况，出现不能被分辨的情况。因此，定义当两个相邻像点之间刚好能被分辨的距离为光学系统的分辨率。荧光显微镜中，根据道威判据，当两个相邻像点之间的距离等于艾里斑半径（a＝0.61）的0.85倍时能被光学系统分辨，此时对应的物方两点的最短距离，即显微镜系统分辨率极限为［17］：

式中：λ为入射光的波长；NA＝nsin θ为显微物镜的数值孔径。从式（3）可知，入射光波长和物镜的数值孔径决定了显微镜的分辨率。

本次搭建的显微系统采用的20×平场消色差长工作距物镜，其数值孔径NA＝0.4，当采用白光LED光源照明（大恒光电GCI-060411，440～670 nm），理论分辨率极限为572～871 nm。为测试系统的分辨率，本次采用1 μm大小的聚苯乙烯（PS）微球（上海译元生物科技有限公司，1 μm）溶液进行测试。实验上将PS微球溶液滴于载破片上并放置于物镜下观察，其测试结果如图3所示。从图3（a）可见，搭建的显微系统可以轻松地分辨出1 μm的PS小球的轮廓。图3（b）所示是相邻微球的图像灰度值分布曲线，通过测量能够清晰测得微球直径和距离。因此，本显微系统分辨率接近此处系统的衍射极限。

3.2 荧光成像测试

搭建的荧光显微镜集白光和激光照明于一体，同时数据采集部分采用双光路设计，通过一个分光镜能够实现图像与光谱共采集，在获得荧光成像图像的同时对其荧光光谱进行实时记录。实验选用CCD（大恒光电，MER-U3-L）进行图像采集，采用USB光纤光谱仪（复亨，FX4000，345～1 148 nm，50 μm slit）进行光谱采集。本实验采用细胞壁经过固绿染色的固定铃兰草根茎切片进行测试，实验结果如图4所示。图4（a）为白光照明下铃兰草根茎切片的明场图像，图4（b）为荧光图像。可见，在激光（半导体激光器，532 nm，3 mW）激发下铃兰草切片能够发出明亮红色荧光，其图像对比度明显优于白光照明［见图4（a）］，极大提高了图像分辨率。如图4（c）所示，本系统可以同时采用双通道照明，即荧光与明场共成像，这样能够显示更多观测物的细节，便于科学研究。

该自制荧光显微镜系统还能通过光谱仪获得荧光成像光谱。从图4（d）所示的光谱曲线可见，荧光光谱范围在550～800 nm（在荧光采集端，为了防止激发光光强太强对光谱仪造成损害，在光谱仪前还额外使用一个550 nm高通滤色片进行过滤），其峰值波长在650 nm左右，与标记的染料荧光信息一致。荧光光谱波长分布蕴含着被测物质的成分结构信息，其荧光强度又与物质含量或浓度等信息相关，结合荧光图像和荧光光谱能够更好地对物质进行定性、定量的分析，因此该自制的荧光显微镜性能优于一般单荧光成像的显微镜。

4 结 语

荧光显微镜在光学显微镜中占据重要地位，被广泛应用于生物学、医学、材料学等多学科领域研究。然而，商业荧光显微镜价格昂贵，集成度高，不适用于教学演示以及功能扩展。本文利用工程光学相关理论，引导学生自主搭建一套集白光照明、激光激发、荧光成像与光谱检测于一体的开放式荧光显微镜，实现了荧光显微镜系统的低成本和高度可扩展性。该综合性实验内容适用于理工科类，特别是光电相关专业本科生的实验教学，作为光学、工程光学、光学设计等课程的实验课程开展。在实验过程中，学生能够亲自动手完成对光学系统元件的选择、基本光路的搭建和系统性能测试，并结合相关理论知识解决搭建过程中遇到的问题，如：利用望远镜系统实现对激光光束的扩束与准直；利用两个反射镜实现光路的抬升以及光路等高共轴调节；利用分光镜实现图像与光谱双光路共采集等问题。在实验过程中，完成对学生理论知识能力、动手实验能力、解决问题能力的综合考察。

此外，本综合实验设计的荧光显微镜属于开放式系统，可以在此基础上进行更多的升级和改造。如在激发光前端增加偏振控制组件和采集端增加检偏装置，就可以实现偏振荧光的检测。另外，针对多重荧光共标记样品，可以通过增加激发光路，实现多路光共激发，从而获得多标记荧光图像。总之，该系统扩展性强，能够满足不同科研需求。在完成该综合性实验后，教师可指导学生以该系统为基础，进行各方面科学研究，进一步申报大学生创新创业、实验科研等项目和光电设计竞赛，促进本科生创新能力的培养。

综上，将开放式荧光显微镜构建实验引入本科生综合实验教学中，有利于理工科学生理论知识的巩固和实验技能的培养。以此为基础，能够进一步激发学生的创新思维和科研探究的兴趣，促进创新性应用型本科人才的培养。