碳青霉烯类异质性耐药铜绿假单胞菌的耐药机制研究

乔涵 胡辛欣 聂彤颖 杨信怡 游雪甫 李聪然,*

(1 中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所 抗感染药物研究北京市重点实验室，北京 100050； 2 中国食品药品检定研究院，北京 102629)

目前，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是引起医院感染的主要条件致病菌[1]。随着抗菌药物的广泛使用，临床中常常出现多重耐药和泛耐药的PA，导致严重且难以治疗的医院获得性感染。免疫力低下患者对PA具有较高的易感性，PA引发的感染在该类人群中可导致较高的病死率[2]。

抗菌谱广，抗菌能力强是碳青霉烯类药物最主要的特征，通常情况下，治疗铜绿假单胞菌感染临床常用β-内酰胺类抗生素。致使PA对碳青霉烯类药物敏感性越来越低，从而产生耐药，临床的医治越来越艰难。2017年，WHO强调要尽快找出对抗耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌(carbapenem resistantPseudomonas aeruginosa,CRPA)的药物，从而治疗细菌感染[3]。但异质性耐药PA的出现，给耐药检测和临床治疗带来了极大的挑战。

异质性耐药是细菌耐药的一种特殊类型，指表面上同源的细菌表现出对特定抗生素部分敏感的现象[4]，即在体外的常规药敏试验中，菌株表现为敏感，如若改用特殊方法检测，则可以发现细菌的大部分亚群属于敏感，但有一小部分亚群属于耐药，极少数亚群甚至表现为高水平耐药，这部分耐药亚群可以导致临床抗生素治疗失败[5]。由于异质性耐药的特殊性、难以治疗性和不可预测性，越来越多的学者开始关注这一特殊现象，并研究如何快速检测与有效治疗异质性耐药菌感染。

抗生素异质性耐药第一次被提出，是在1947年的革兰阴性流感嗜血杆菌中[6]，而革兰阳性葡萄球菌被发现有异质性耐药现象大约是在20年以后[7]，但是第一次用“异质性耐药”一词是在1970年。筛选异质性耐药菌株的方法中最被认可的是群体分析法(population analysis profiling，PAP)，被认为是鉴定异质性耐药的金标准[5]。菌落计数PAP方法与标准细菌MIC测定方法相同，目的抗生素浓度梯度设定为2倍，并通过涂布平板菌落计数对异质性耐药进行判定。如果抗生素对细菌展现最大抑制效果的最低药物浓度(highest inhibitory concentration，HIC)高于8倍的对细菌没有抑制效果的最高药物浓度( highest noninhibitory concentration，HNIC)[4,8-9]，那该菌株就可被定义为异质性耐药菌株。其他方法还包括纸片法或E-test纸条法。E-test纸条法是将菌液调至2.0麦氏单位后，均匀涂布于MH平板，贴相应的E-test试纸条，37℃孵育48 h后观察抑菌圈内是否有个别耐药菌落生长的方法。

本研究的主要目的是鉴定筛选碳青霉烯类(亚胺培南)异质性耐药临床分离铜绿假单胞菌，并探究其异质性耐药的可能机制，为碳青霉烯类异质性耐药铜绿假单胞菌感染的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

标准菌株：铜绿假单胞菌ATCC 27853；实验菌株：铜绿假单胞菌临床分离株30株，来自于中国医学科学院病原微生物菌(毒)种保藏中心药用微生物相关菌(毒)种保藏分中心(CAMS-CCPM-A)。

1.2 E-test 试纸条法

临床菌株的培养按照《全国临床检验操作规程》操作[10]，E-test试纸条按照说明书操作，37℃培养48 h后，观察抑菌圈形状，和抑菌圈内是否有零星菌落。若抑菌圈内有零星菌落或抑菌圈边缘不清，则判断为可能异质性耐药菌株。若没有，则按照抑菌圈与E-test纸条的交界读数。若在纸条两边有不同的交点，读取较高值，如果差值大于1稀释度，则为无法正确读数。E-test结果为耐药的菌株和无法正确读数的菌株也列入异质性耐药疑似菌株中。通过E-test试纸条法检测为异质性耐药的菌苔特征示意图见图1(抑菌圈内有零星菌落)。

图1 E-test试纸条法检测为异质性耐药的菌苔特征Fig.1 Bacterial characteristics of the heteroresistant strains by E-test

1.3 群体分析法(PAP)

挑取新鲜平皿中的各菌株单菌落接种至CAMH培养基中37℃静置培养过夜。配制含不同浓度药物平皿，药物浓度为0、0.06、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64和128 μg/mL。将过夜菌液10倍系列稀释，分别涂布于含不同浓度亚胺培南的各个平皿上，37℃培养48 h后计数各平皿上菌落数，异质性耐药菌株判定标准为：对细菌最大抑制效果的最低药物浓度(HIC)与对细菌没有抑制效果的最高药物浓度(HNIC)的比值大于8[9]。

1.4 最小抑菌浓度(MIC)测定

参照CLSI标准[10]，测定菌株对盐酸环丙沙星、多黏菌素B、头孢他啶、美罗培南、庆大霉素、左氧氟沙星的MIC值，浓度测定范围为0.06～128 μg/mL。

1.5 全基因组三代测序与二代重测序

1.5.1 全基因组测序菌株

将铜绿假单胞菌16-24进行PAP试验，将在含 4 μg/mL亚胺培南平皿上生长的单菌落保存并命名为铜绿假单胞菌24-4；用铜绿假单胞菌24-4进行PAP实验，在4 μg/mL和8 μg/mL亚胺培南含药平皿上生长的单菌落保存并命名为铜绿假单胞菌24-4-4和铜绿假单胞菌24-4-8；将铜绿假单胞菌24-4在无药平板上连续传代5 d后再用PAP法筛选菌株，在含8 μg/mL亚胺培南平皿上生长的单菌落保存并标号为铜绿假单胞菌24-45-8。

通过PAP试验发现，这5株同源菌株在亚胺培南诱导下，异质性变大，但当无药物诱导连续传代后，异质性有变小趋势，如表3。将铜绿假单胞菌16-24做三代基因组测序后作为对照组，铜绿假单胞菌24-4、铜绿假单胞菌24-4-4、铜绿假单胞菌24-4-8、铜绿假单胞菌24-45-8做二代基因组重测序作为实验组，比对实验组是否有与异质性耐药相关的基因突变。

1.5.2 测序方法

三代测序：按照Wizard®基因组DNA纯化试剂盒(Promega)说明书进行基因组DNA提取，纯化后建库测序。制备的文库在Illumina HiSeq X Ten仪器上进行双端测序。利用PacBio RS Ⅱ对Illumina平台生成的数据进行生物信息学分析。利用Glimmer对基因组中的编码序列(CDS)进行预测，质粒基因采用GeneMarkS软件预测，用tRNAscan-SE进行tRNA预测，用Barrnap进行rRNA预测。利用BLAST、Diamond、HMMER等序列比对工具，从NR、Swiss-Prot、Pfam、GO、COG、KEGG数据库中对预测到的CDS进行蛋白功能注释。

二代重测序：提取并检测DNA样本后构建DNA文库，通过桥式 PCR后，Illumina Xten测序，利用trimmomatic软件对原始下机数据进行质控，以保证后续分析结果的准确性。通过 BWA 软件将有效测序与参考基因组比对，并利用SAM tools软件标记重复序列。使用BreakDancer对SV进行检测，过滤PE reads支持数小于4的SV，并使用ANNOVAR对其中的DEL、INS、INV进行注释。与此同时，利用Cnvnator软件对CNV 进行检测。

1.6 PCR检测耐药相关基因突变

通过全式金细菌基因组提取试剂盒提取原始菌株和耐药菌株全基因组DNA，PCR检测诱导耐药株中是否确有基因突变，所需引物见表1。

2 结果

2.1 E-test纸条法初筛异质性耐药疑似株

采用E-test纸条对30株临床分离铜绿假单胞菌进行异质性耐药初筛，得到表2数据，40%(12株)的菌株为异质性耐药疑似菌株。

2.2 PAP法确定异质性耐药菌株

将异质性耐药疑似菌株和标准菌株铜绿假单胞菌ATCC 27853同时用PAP法验证菌株是否为异质性耐药，结果如表3，从12株异质性耐药疑似菌株中通过PAP方法确定了8株异质性耐药菌。

表3 PAP法验证异质性耐药菌株Tab.3 Validation of the heteroresistant strains by PAP method

2.3 异质性耐药株对其他药物的敏感性

用肉汤微量稀释法测各菌株对其他药物的MIC值，得出各菌株对其他药物敏感性的累计百分率，结果如图2所示。根据CLSI中铜绿假单胞菌对各药物的耐药标准，计算出各异质性耐药菌株对其他药物的耐药率，结果显示，异质性耐药株对多黏菌素B、头孢他啶、美罗培南耐药率较高，对其他药物相对更敏感。

图2 异质性耐药菌株对其他药物的敏感性Fig.2 Susceptibility of heteroresistant strains to other drugs

2.4 全基因组测序及PCR验证结果

将铜绿假单胞菌16-24做三代基因组测序后，采用Circos v0.64(http://circos.ca/)软件绘制基因组圈图(图3)。其余菌株做二代基因组重测序，比对铜绿假单胞菌16-24数据，利用BWA比对软件将质控后的测序片段比对回参考基因组；利用Picard-tools去除PCR duplication 产生的测序片段。分析4479个不同基因片段，未发现在实验组中发生多拷贝的片段或基因。

图3 铜绿假单胞菌16-24基因组圈图Fig.3 Genome circle map of P.aeruginosa 16-24

根据测序结果并排除组装错误，我们筛选出可能与异质性相关的基因突变并通过PCR扩增进行验证。扩增长度为1～1.5 kb的片段，PCR产物送生工生物工程上海股份有限公司测序并与原始菌株的PCR产物序列进行比对。结果如表4所示，得到的PCR产物与母体菌株铜绿假单胞菌16-24相比，除gene3279、gene5991、gene5622 3个基因更换引物后仍未扩增出外，其余基因均未突变。

表4 确证SNP位点结果数据统计表Tab.4 Confirmed SNP locus result data statistics table

gene5991是与酰基脱水酶有关的基因，但关于这个细菌蛋白质家族没有已知的功能。gene5622是一个假定蛋白，目前还没有关于其功能的描述。因此，我们把研究重点放在gene3279上，一个与双功能乙醛酸/羟基丙酮酸还原酶有关的基因。由于gene3279长度为985 bp，片段长度较短，若基因内部片段发生翻转，会导致测序时可以正常拼接，但扩增时，更换多个引物也不能有效扩增出产物的情况，因此我们判断gene3279有可能为基因内部片段发生翻转，或基因内形成发卡结构等原因不能有效扩增，但不论如何，都可能使该基因编码的蛋白发生改变甚至失活。

最外面一圈为基因组大小的标识，每一个刻度为0.1 Mb；第二圈和第三圈为正链、负链上的 CDS，不同的颜色表示CDS不同的COG的功能分类；第四圈为 rRNA 和 tRNA；第五圈为GC含量。

3 讨论

β-内酰胺类抗生素，到目前为止是临床治疗重症PA感染的一线用药，若临床治疗中遇到药敏试验显示碳青霉烯类敏感的异质性耐药菌，很可能错过最佳治疗时间，甚至发展成多重耐药菌，对临床治疗造成巨大风险。因此，探索异质性耐药PA在临床分离菌株的分布情况和异质性耐药的产生机制十分必要。

E-test纸条法筛查异质性耐药菌株简便快捷，但纸条价格偏高，且根据实验，筛查异质性的假阳性率为9.09%。PAP法虽然是实验室鉴定异质性耐药菌株的金标准，但所消耗的时间与人力财力极大，现实临床治疗中难以实现。故根据本研究结果，E-test纸条法是目前相对较为合理的临床筛查异质性耐药的方法。

微量肉汤稀释法测各菌株对其他药物的MIC结果显示，对于亚胺培南异质性耐药的PA，似乎显示出对多黏菌素B、头孢他啶、美罗培南耐药率较高，而对其他药物的耐药率并不高。诚然，可能因为异质性耐药菌样本数量不足导致的结果误差。但就目前结果看来，亚胺培南异质性耐药菌株对环丙沙星等的敏感性似乎很高，与文献中推荐的在临床治疗中，若某菌株初步鉴定为异质性耐药菌，则可优先考虑环丙沙星等药物进行联合治疗[11]，为挽救重症患者生命争取宝贵的治疗时间相一致。

遗传分析表明，大多数异质性耐药是不稳定的，通常由自发串联扩增已知的耐药基因，引起细菌亚群的耐药性增加[12]。且实验中发现铜绿假单胞菌16-24在PAP实验过程中，虽结果为异质性，但每次异质性范围有一定差距，故我们将铜绿假单胞菌16-24作为重点研究对象进行进一步的机制研究。根据对异质性耐药菌株的全基因组测序和重测序数据分析，未发现突变体中发生多拷贝的大片段，也未发现在突变体中发生多拷贝的基因。

异质性耐药在基因层面的机制还有可能是某重要基因突变造成。根据三代基因测序结果并排除组装错误，除gene3279、gene5991、gene5622 3个基因更换引物后PCR未扩增出片段外，其余基因均未突变。gene3279是一个与双功能乙醛酸/羟基丙酮酸还原酶有关的基因，编码EF-P(延伸因子 P)是一种必需蛋白质，在细菌中可刺激蛋白质合成中第一个肽键的形成[13-14]。EF-P由Glick和Ganoza于1975年发现[15]，它可能通过改变核糖体对氨酰-tRNA 的亲和力间接发挥作用，从而增加它们作为肽基转移酶受体的反应性[14]。EF-P不是最小体外翻译系统的必要组成部分，但EF-P 的缺失会限制翻译速率、抗生素敏感性和细菌的生长速率都会被影响。gene5991可能是与酰基脱水酶有关的基因，但关于这个细菌蛋白质家族没有已知的功能。一些成员将蛋白质注释为Mn2+/Zn2+转运系统的渗透酶成分，但这无法得到证实。Gene5622是一个假定蛋白，目前还没有关于其功能的描述。对于靶基因不能通过常规手段扩增问题，近期有研究表明，基因中某些片段的倒位翻转有可能导致正常设计引物后，靶基因无法扩增。若基因片段翻转，该基因编码的蛋白则无法正常表达，致基因失活，从而可能导致细菌的异质性耐药。因此，铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物的异质性耐药有可能与EF-P有关。

综上所述，探索PA对碳青霉烯类药物异质性耐药的机制，以发现更有效的对抗耐药的靶点是极为必要的。后续我们会继续从基因、转录以及翻译等层面，探索PA异质性耐药的机制。本文中阐述的方法、结果及机制希望可以对临床治疗和基础探究提供参考。