抑癌基因TP53突变状态与三阴性乳腺癌病人预后的研究

杨崔燕，王豪雨，陈小松，沈坤炜

（上海交通大学医学院附属瑞金医院外科 乳腺疾病诊治中心，上海 200025）

截至2020年，女性乳腺癌已成为全球最常见的新发癌症[1]。其中三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）发病占 12%～17%[2]。与其他乳腺癌亚型相比，TNBC具有侵袭性较高、远处转移率较高及预后较差等特点[3]，是乳腺癌治疗领域的研究热点和难点。近年来，随着二代测序技术的发展以及分子生物学的进步，越来越多的研究开始关注TNBC的基因突变情况。抑癌基因TP53是TNBC中突变频率较高的基因之一[4]，在细胞增殖和凋亡方面起到重要调节作用。TP53具有多种突变类型，包括错义突变、移码突变、无义突变和剪切突变等[5]。既往研究中，TP53基因突变对于乳腺癌的生存预后影响不一[6]，尤其不同突变类型对于早期TNBC病人的预后影响尚不明确。本文旨在研究TNBC病人TP53基因体系突变的频率和类型及其与临床病理特征的关系，并对TP53突变与无复发生存（relapse-free survival,RFS）、生存（overall survival,OS）和远处无复发生存（distant relapse-free survival,DRFS）的相关性进行探索。

资料与方法

一、研究对象

回顾性纳入2012年1月至2019年3月于本院乳腺疾病诊治中心接受手术治疗的早期浸润性TNBC病人。排除肿瘤长径＜1.0 cm、新辅助化疗后达到病理完全缓解（pathological complete response,pCR）及组织标本无法获取的病人。收集入组病人的临床病理资料，包括年龄、月经状态、肿瘤大小、淋巴结状态、病理类型、组织学分级、细胞增殖抗原（Ki-67）表达水平、脉管癌栓、手术方式、是否接受放化疗、铂类药物使用情况和同源重组修复（homologous recombination repair,HRR）基因突变情况。TNBC定义标准为肿瘤组织标本中雌激素受体（estrogen receptor,ER）和孕激素受体（progesterone receptor,PR）染色细胞＜1%[7]，同时结合免疫组织化学染色和荧光原位杂交 （flourescence in situ hybridization,FISH）判定人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2,HER2）状态为阴性[8]。肿瘤TNM分期参照美国癌症联合会（第8 版）[9]。

二、标本获取及二代测序方法

入组病人的肿瘤组织标本经4%甲醛溶液固定、石蜡包埋后，采用MagPure FFPE DNA LQ Kit（Magen）试剂盒提取DNA。在Illumina MiSeq高通量测序平台上采用AmoyDx NGS data analysis system(ANDAS)检测基因突变情况。参考2015版美国医学遗传学与基因组学学会和分子病理协会制定的指南 （American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology，ACMG/AMP指南），本研究将致病性突变及可能致病性突变定义为发生基因突变，将良性突变及不明确致病性的突变定义为未发生基因突变[10]，致病性突变及可能致病性突变判断标准详见表1。

表1 ACMG/AMP指南致病性及可能性致病突变判断标准

三、随访方法及临床终点评估

入组病人于本院乳腺疾病诊治中心接受规律随访，术后2年内每3个月随访1次，术后3～5年每半年随访1次，其后每年随访1次。随访信息收集来自电话随访、门诊病历、住院病历及主诊医师提供。参考2.0版乳腺癌辅助治疗临床试验中疗效终点标准化定义（standardized definitions for efficacy end points,STEEP）更新[11]，RFS 定义为手术日期至乳腺癌复发（包括同侧浸润性乳腺癌复发、局部区域浸润性乳腺癌复发和远处复发）或任何原因致死之间的时间；OS定义为手术日期至任何原因致死之间的时间；DRFS定义为手术日期至乳腺癌远处复发或任何原因致死之间的时间。

四、统计学方法

所有数据均采用R软件（4.1.2版）和 SPSS（26.0版）进行分析。组间比较采用卡方检验。多因素分析采用Logistic模型，结果以优势比（odd ratio,OR）、95%置信区间（confidence interval,CI）及 P 值展示。单因素及多因素生存分析采用COX比例风险回归模型，结果使用风险比 （hazard ratio,HR）、95%CI及P值展示。生存曲线采用Kaplan-Meier法分析，组间生存曲线比较进行Log-Rank检验。亚组分析采用COX单因素比例风险回归模型分析，交互作用使用似然比检验法 （likelihood ratiotest,LRT）。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、TNBC病人的临床病理特征

本研究共纳入234例早期TNBC病人。其中，年龄＞50岁133例（56.84%）；绝经后130例（55.56%）。接受新辅助化疗37例（15.81%）。肿瘤长径＞2.0 cm为 134例 （57.26%）。存在淋巴结转移 102例（43.59%）。病理类型为浸润性导管癌 205例（87.61%）。 组织学Ⅲ级172例 （73.50%）。Ki-67＞30%为173例（73.93%）。接受单纯乳房切除152例（64.96%）。术后接受辅助化疗226例（96.58%）。使用铂类药物116例 （49.57%）。接受放疗161例（68.80%）。局部复发30例（12.82%），出现远处转移33例（14.10%）。存在同源重组修复（homologous recombination repair,HRR）基因突变55例（23.50%）（见表2）。

表2 病人基线特征及TP53突变分布情况[n（%）]

二、TP53突变频率及突变类型

234例TNBC病人中，144例（61.54%）肿瘤组织存在TP53突变，其中1例同时具有2个TP53突变位点（p.P316Sfs*21和p.Y220C）。大多数突变分布在第5～8个外显子区域（109例，75.69%）。排名前5的热点突变为：p.R273H （7例，2.99%）；p.R175H （5 例，2.14%）；p.R213* （5 例，2.14%）；p.R273C（4 例，1.71%）和 p.Y220C（4 例，1.71%）（见图1）。根据突变类型，将TP53突变人群进一步分为错义突变组 （85例，59.03%）和非错义突变组（59例，40.97%），其中，非错义突变类型包括移码突变（28 例，19.44%）、无义突变（14 例，9.72%）、框内突变（4例，2.78%）和剪切突变（13例，9.03%）。亦可根据突变位点分类，将发生在DNA结合结构域（DNA-binding domain,DBD）及其他结构域的TP53突变分为两类。本研究中DBD相关突变占比为46.58%，其中73.39%为错义突变；非DBD相关突变占比为53.42%，其中错义突变仅占28.00%。

图1 TP53突变位点

三、TP53突变与临床病理特征的相关性

单因素分析发现，TP53突变相较于TP53野生型病人的组织学分级较高 （Ⅲ级占比为79.17%比64.44%，P=0.013），且 Ki-67＞30%的占比较高（Ki-67＞30%占比为 80.56%比 63.33%，P=0.004）。 两组其他临床病理特征差异无统计学意义（见表2）。进一步将单因素分析中具有统计学意义的特征纳入多因素分析。结果提示，TP53突变与Ki-67高表达显著相关 （OR=2.40，95%CI:1.32～4.40，P=0.004）。进一步对TP53不同突变类型的临床病理特征进行比较发现，错义突变与非错义突变两组基线特征分布平衡（P值均＞0.05，见表3），差异无统计学意义。

表3 TP53突变病人基线特征及错义突变分布情况[n（%）]

四、TP53突变与预后的相关性

经过52个月的中位随访，234例中63例出现复发（30例局部复发、33例远处转移），43例死亡。其中，TP53突变病人出现38例复发 （20例局部复发、18例远处转移）和21例死亡，5年RFS率、OS率及DRFS率分别为74.3%、86.5%和85.4%。TP53野生型病人出现25例复发 （10例局部复发、15例远处转移）和22例死亡，5年RFS率、OS率及DRFS率分别为65.6%、73.7%和76.7% 。TP53突变型组与TP53野生型组的RFS、OS及DRFS差异均无统计学意义（P值分别为 0.447、0.083和 0.131，见图2）。进一步，对于TP53不同突变类型的病人预后进行分析发现，TP53错义突变病人与其他突变类型病人的RFS、OS及DRFS期差异亦无统计学意义（分别 P=0.226、P=0.885 和 P=0.172，P 值均＞0.05，见图2）。

图2 不同TP53状态病人生存曲线

对入组病人的生存预后进行单因素分析，结果提示年龄＞50岁、肿瘤长径＞2.0 cm、存在淋巴结转移和脉管癌栓阳性与不良RFS显著相关 （P值均＜0.05，见表4）。同时除年龄以外的其余3项也是影响OS的独立危险因素（P值均＜0.05，见表5）。对于DRFS，仅肿瘤长径＞2.0 cm及淋巴结阳性为其独立危险因素（P值均＜0.05，见表6）。为去除临床病理特征对TP53预后作用的干扰，将TP53突变与否与单因素分析结果有意义的临床病理特征纳入生存预后的多因素分析，结果提示，TP53突变与否与RFS无显著相关 （HR=0.67,95%CI:0.41～1.08,P=0.102），而TP53突变是OS及DRFS的保护性因素（HR=0.49,95%CI:0.27～0.90,P=0.022;HR=0.54,95%CI:0.30～0.99,P=0.047）。

表4 总人群RFS单因素及多因素COX生存分析

表5 总人群OS单因素及多因素COX生存分析

表6 总人群DRFS单因素及多因素COX生存分析

五、TP53状态对预后作用的亚组分析

根据病人不同临床病理特征进行亚组分析，探索TP53突变对预后的影响及其与其他临床病理特征是否具有交互作用（见图3）。对于RFS的分析结果提示，TP53突变与病人年龄及月经状态在对RFS的预测中存在交互作用 （交互作用P值均＜0.05）。在年龄≤50岁以及绝经前/围绝经期的亚组中，TP53突变型病人的RFS优于野生型病人。在针对OS的亚组分析中，TP53与年龄及月经状态无显著交互作用。DRFS的亚组分析中发现仅年龄与TP53存在显著交互作用（P=0.044，见图4），在年龄≤50岁的病人中，TP53突变为保护因素。

图3 TP53对RFS及OS预后作用亚组分析

图4 TP53对DRFS预后作用亚组分析

讨 论

TNBC作为乳腺癌的一种高危亚型，其基因特征和预后标志物亟待研究。TP53突变是TNBC中发生频率最高的抑癌基因突变事件。为探索TP53突变与TNBC预后的相关性，本研究回顾性纳入234例早期TNBC病人进行测序检测与生存分析，结果显示TP53突变较野生型病人拥有更高的Ki-67表达，且两者预后差异无统计学意义。

本研究TNBC病人TP53突变率为61.54%。既往文献报道TNBC病人TP53突变率为55%～88%[12-14]，与本研究结果类似。在突变位点的分布上，既往文献发现，TNBC病人中TP53突变主要集中在DBD中，且突变类型大多为错义突变[15]，本研究发生在DBD的突变比例为46.58%，其中73.39%为错义突变。本研究TP53的高频突变位点依次为p.R273H、p.R175H、p.R213*、p.R273C 和 p.Y220C，其中p.R273H突变频率为2.99%。Pollock等[16]的研究对IARC、TCGA及METABRIC中乳腺癌病人的TP53突变情况进行联合分析，发现乳腺癌中TP53的高频突变位点包括 p.R175H、p.R248Q、p.R273H和p.R248W。其中，p.R175H突变频率最高，为4.7%，与本研究的最高频突变位点存在差异。可能是由于该研究纳入不同种族及不同分子分型的病人，其中亚洲人群占24.00%，TNBC仅占总人群的36.00%。同时，另外一项针对METABRIC和TCGA数据库的研究亦证实，乳腺癌中TP53的最高频突变位点为p.R175H（1.82%），提示乳腺癌总人群的TP53最高频突变位点可能与TNBC存在差异[17]。肿瘤中不同的TP53突变位点与不同的功能和预后相关。针对结肠直肠癌的研究提示，TP53 R273H突变与更强的侵袭及转移功能相关，携带该突变的病人预后显著劣于携带TP53 R175H突变的病人[18]。因此，TNBC病人与其他分子分型病人不同的TP53高频突变位点可能与不同的生存结局相关。

在临床病理特征方面，本研究发现，相较于TP53野生型病人，TP53突变型病人肿瘤组织中Ki-67＞30%的占比显著升高。亦有研究发现在乳腺癌总人群中Ki-67≥25%的病人TP53突变的发生频率更高[19]。这一结果与本研究相似，但该研究并未对TNBC亚组人群进行分析。TP53是重要的抑癌基因和转录因子。在DNA发生损伤或细胞遭受物理或化学压力时，TP53上调下游p21等基因的表达，发挥细胞周期阻滞作用，进而发挥抑癌功能。当TP53发生突变时，可导致这一功能丧失，从而促进细胞周期进程，增加肿瘤细胞的增殖活性[20]。因此，在TNBC病人中，TP53突变提示更高的肿瘤增殖水平，可能成为肿瘤恶性程度的评估指标。

在生存分析方面，本研究TP53野生型与突变型病人的RFS、OS及DRFS差异均无统计学意义。既往研究对于TP53在乳腺癌病人中与预后的关系结论不一。Basho等[12]发现在转移性乳腺癌病人中TP53突变与更短的 RFS及 OS显著相关 （P＜0.001）。然而该研究纳入的均为晚期乳腺癌病人，TNBC仅占18.3%，未对TNBC人群进行分析。提示TP53突变对于不同阶段肿瘤的生物学行为可能发挥不同的作用。此外，有研究表明，在TNBC病人中，TP53突变是不良预后的危险因素，但在应用化疗的TNBC病人中，TP53突变与否对于生存无显著影响[21]。本研究TNBC病人，其中226例（96.58%）均接受化疗，可能部分解释两组病人的RFS及OS差异无统计学意义。此外，TP53不同突变类型的预后作用尚不统一。本研究TP53错义突变与非错义突变的TNBC病人预后差异无统计学意义。2006年一项研究显示，TP53在DBD发生突变的乳腺癌病人中，错义突变与其他突变类型对于预后的影响差异无统计学意义[15]。然而，另一项研究分析804例中国乳腺癌病人循环肿瘤DNA的TP53突变情况。结果表明，发生在外显子5～8的TP53突变是影响DFS的独立危险因素 （P=0.009），但对于其在TNBC亚组人群的预后作用尚不明确[21]。因此，TNBC人群中，TP53突变对预后的影响尚待进一步探索。除TP53外，可能存在其他更重要的基因突变驱动事件。

综上所述，本研究回顾性分析早期TNBC人群的TP53类型及生存预后发现，TP53为TNBC的高频突变 （61.54%），p.R273H为其高频突变位点，TP53突变与更高的Ki-67＞30%占比相关，但其对TNBC病人的预后作用尚待进一步研究。