循环肿瘤DNA和循环肿瘤细胞检测乳腺癌微小残留病灶的研究

潘睿忻 综述 陈小松，沈坤炜 审校

（上海交通大学医学院附属瑞金医院外科 乳腺疾病诊治中心，上海 200025）

乳腺癌已成为全球女性最常见的肿瘤类型，2020年全球有近230万新发病例，占所有肿瘤病例的11.7%[1]。随着医疗水平的进步，乳腺癌治疗后生存率显著提高。但仍有20%～30%的病人面临复发及转移的风险，导致不良预后[2]。其中，部分乳腺癌病人在接受治疗后，虽达到完全缓解（complete remission,CR），但仍在随访期间复发，引起广泛关注。部分学者认为，这些病人经过治疗后体内残存的少数肿瘤细胞或微小病灶，是转移与复发的关键[3]。这些影像学手段无法检测到的残留病灶被称为微小残留病灶 （minimal residual disease,MRD）。MRD是引起乳腺癌病程进展及复发的重要因素之一，在预后及疗效评估、复发监测及治疗指导中具有潜在的应用价值和潜能。本文就乳腺癌MRD的检测方法以及临床意义作一综述。

乳腺癌MRD临床检测方法

目前MRD主要通过液体活检检测[4]。液体活检是对循环中的肿瘤细胞，或由肿瘤细胞产生并释放到体液中的遗传物质定量检测，从而判断病人的肿瘤负荷。检测对象包括循环肿瘤细胞（circulating tumor cell,CTC）、游离 DNA（cellfree DNA,cfDNA）、循环肿瘤DNA （circulating tumor DNA,ctDNA）和外泌体等。目前对ctDNA及CTC的临床研究取得不错的结果，并在临床中逐步应用。

一、ctDNA

ctDNA是指由肿瘤原发灶、转移灶或CTC凋亡、坏死或主动分泌到体液循环中的短DNA片段。通常长度在100～200 bp，可存在于血液、淋巴液、脑脊液、胸腔积液等体液中[4-5]。

目前常用以下两种策略来评估ctDNA的水平[6]。第一种为肿瘤知情分析（tumor-informed assay），先对肿瘤组织行全外显子（whole exome sequencing,WES）检测，用配对血作为对照以排除非肿瘤来源的基因变异。针对肿瘤组织WES检测结果定制个性化的基因组合（panel），并对外周血ctDNA行超深度测序，实现对病人个体化分析与肿瘤负荷跟踪，灵敏度较好[7]。另一种则为肿瘤不知情分析（tumor-agnostic assay），即通过预先设定的固定panel进行ctDNA检测。检测方法包括肿瘤个体化分析深度测序（cancer personalized profiling by deepsequencing，CAPP-Seq）等。

两种检测策略均有较成熟的检测商品用于临床与基础研究。肿瘤知情分析策略的代表方法为Natera公司的Signatera系统，已获美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration,FDA）批准投入临床使用。此外，还有数字化聚合酶链式反应技术，磁珠乳液扩增技术（bead-emulsionamplification-magnetic,BEAMing），安全测序系统技术（Safe-SeqS）等。基于肿瘤不知情分析策略的检测系统，包括2020年经FDA批准的第二代测序技术（next-generation sequencing，NGS）检测：FoundationOne Liquid CDx 和 Guardant360 CDx。二者均广泛应用于乳腺癌、非小细胞肺癌 （non-small cell lung cancer,NSCLC）、前列腺癌等晚期肿瘤病人靶向治疗的伴随诊断[8]。

在此基础上，ctDNA表观遗传信息改变的检测亦备受关注，其与ctDNA基因突变情况综合判断，在提高检测敏感性和准确性的同时，亦可排除体细胞突变的干扰。Guardant RevealTM液体活检产品综合ctDNA的甲基化水平及突变情况，将检测灵敏度提升至91%。由约翰霍普金斯大学金梅尔癌症中心[9]开发的LBx-BCM试剂盒利用对特定基因甲基化水平的检测，实现对晚期乳腺癌病人ctDNA的快速检测。

这两种策略均有各自的优缺点。前者灵敏度更高，在个体化监测及对复发转移的精准追踪中临床应用广泛。多项针对高危乳腺癌病人的疗效监测及转移复发的临床试验中[7,10-14]，用于病人肿瘤负荷的连续追踪。但由于其检测panel基于原发灶基因突变，因此对新发病灶和治疗过程中新发突变的检测能力尚有不足。后者则可检测出原发病灶中代表性不足的亚克隆突变及在治疗期间药物选择压力造成的新发突变，特定突变基因的追踪检测效益高。但panel包含过多突变靶点时，检测敏感性相对不足，因此需更多的循环血样本量或样本中有更高的ctDNA水平才可检出阳性[15]（见表1）。

表1 肿瘤知情分析与肿瘤不知情分析策略对比

在临床及基础研究中针对MRD，具体如何行ctDNA检测目前尚无定论。多项临床研究及实践证实ctDNA在多种实体瘤的早期辅助诊断、临床用药指导、靶向药物伴随诊断、疗效监测、不良预后预警及耐药机制探索中均有一定临床价值。国内2018年专家共识[16]提出，在监测肿瘤病人是否含有已知的靶向治疗敏感或耐药性突变时可使用突变扩增系统。《ctDNA高通量测序临床实践专家共识（2022年版）》[17]指出，NGS可作为晚期实体肿瘤的伴随诊断方法，并作为难以完成组织活检的恶性肿瘤组织基因检测替代方法。同时，在靶向或免疫检查点抑制剂治疗的疗效评估以及分子靶向治疗耐药机制的识别中，NGS亦有一定的临床价值。但共识也指出，目前临床广泛开展ctDNA-NGS检测仍需更高水平的循证依据，并需对开展相关检测的病人在检测价值、必要性、局限性以及费用上作充分知情告知。国际指南方面，美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network,NCCN）2021年第2版结肠直肠癌指南指出，ctDNA是直肠癌术后可靠的预后生物学标志物，具有指导辅助治疗的潜力。2022年第3版NSCLC临床实践指南[18]指出，ctDNA可作为组织替代样本，于靶向药物治疗开展及转移病灶诊断中作为附加手段。但目前检测方法及检测策略如何选择与进行仍缺乏相关指南的指导。乳腺癌ctDNA目前主要聚焦于晚期乳腺癌临床用药指导[19]。对局部复发不可切除或转移性激素受体（hormone receptor,HR）阳性、人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2,HER2）阴性乳腺癌病人在使用磷脂酰肌醇3'-激酶抑制剂或激素治疗前，应使用NGS检测ctDNA中是否存在磷酸肌醇3激酶的p110α催化亚基 （p110 catalytic α subunit of phosphoinositol 3 kinase,PIK3CA）突变；同时在转移性HER2阴性的乳腺癌病人应在使用聚二磷酸腺苷核糖聚合酶 （poly ADP-ribose polymerase,PARP）抑制剂治疗前，完善基因的检测以明确BRCA1/2致病性突变或可能致病性突变的存在性。上述临床指导在2022年美国临床肿瘤学会（American Society of Clinical Oncology,ASCO）大会中均为高证据质量及强推荐的指南建议[19]。

二、CTC

CTC是指肿瘤的原发灶或转移灶在自身肿瘤组织不稳定或外界刺激下，自发或被动地脱落到外周循环中的肿瘤细胞，在肿瘤的转移过程中发挥重要作用[20]。一旦CTC成功逃避免疫监视并在血流剪切力中存活，于靶器官微环境中定植，就可实现肿瘤转移，进而产生转移病灶[21]。

外周循环的CTC含量较低。即使是在晚期转移性癌症病人中，与正常细胞比例也接近1/109。因此，CTC的富集分离与检测是CTC分析过程中的关键步骤[22]。CTC的富集分离主要利用CTC的物理学及生物学两种特性[22]。针对CTC与正常循环中细胞相比，体积较大、密度较小、变形性较低并有不同细胞电学表现的物理特征[23]，应用密度梯度离心法、过滤法以及电学原理的OncoQuick系统、ISET系统与DEPArrayTM。但由于CTC物理学特性异质性较大，上述方法的灵敏度及特异度均不理想。生物学方法则是通过免疫学方法对CTC表面标志物进行分析，包括对特异性肿瘤相关抗原的阳性富集及对白细胞共同抗原CD45的阴性富集[23]。其中已获FDA批准的CellSearch系统，是利用对CTC特异性表达上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）进行阳性富集的评估系统。富集分离后，利用包括荧光原位杂交、免疫细胞化学及反转录聚合酶链反应/实时荧光定量聚合酶链反应等技术，对CTC中DNA、mRNA、miRNA及蛋白质的含量及遗传特征等分析[4]，以评估肿瘤复发事件。

CTC检测的优势在于同时多维度分析DNA、RNA及蛋白质，且可表征肿瘤内部异质性[4]。但当前对CTC富集分离及检测技术的特异性均不足。由于检测过程需多种技术参与，检测难度大，且CTC含量低，使得CTC检测在实际应用中受限。

MRD检测在乳腺癌临床诊治中的应用

乳腺癌病人复发与转移提示不良预后[2]。乳腺癌病人检出MRD，常提示高复发、转移风险[3]。因而MRD检测及其临床应用研究的进一步开展，具有非常重要的临床意义。

一、MRD与乳腺癌病人的预后预测

MRD在多种实体瘤病人中证实与预后相关[24]，在乳腺癌中亦有多项临床研究证实这一观点。Olsson等[10]对术后早期乳腺癌病人行半年1次血样本采集，并分析全部入组病人肿瘤原发病灶染色体重排情况，设计血样本中ctDNA的检测引物，发现基于ctDNA的MRD检测阳性对乳腺癌术后转移的预估灵敏度为93%，特异度为100%，是早期乳腺癌病人不良预后的重要影响因素之一。且随着病人血样本ctDNA浓度的增加，其复发风险亦显著增加。Trapp等[25]在早期高危乳腺癌病人接受辅助化疗后2年对CTC检测，发现CTC阳性与较差的总生存率和无病生存期（disease-free survival,DFS）相关，是导致病人不良预后的独立危险因素。进一步亚组分析发现，在luminal A型、luminal B型及三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）中，CTC 阳性与不良预后显著相关。Radovich等[26]对BRE12-158临床试验中接受过新辅助治疗的早期TNBC病人辅助治疗阶段血样本进行二次分析发现，ctDNA及CTC阳性均与更短的无远处疾病生存期（distant disease-free survival，DDFS）、DFS 相关。综合ctDNA与CTC的结果可增加MRD检出的敏感性和特异性，二者均为阳性的病人预后更差，提示MRD可为早期乳腺癌病人临床风险分层提供依据。

MRD阳性与早期乳腺癌高复发、转移风险相关，那么是否可将MRD检测结果作为乳腺癌辅助治疗后随访的危险分层因素之一，并在随访期间增加MRD检测？一项泛实体瘤分析发现，相较于标准治疗后单次检测，对ctDNA-MRD多次、连续动态检测可大幅度提高检测的敏感性[24]。何时开始MRD检测以及检测频率，目前尚无标准。较多研究选择在实体瘤病人接受标准手术和辅助化疗后开始MRD检测，之后间隔2～12个月不等连续监测。针对乳腺癌病人，MRD随访检测的标准制定，亦需开展更大样本量及长期随访的临床研究以提供更多证据支持。

对于晚期乳腺癌，ctDNA检测亦可作为预后的预测指标。Turner等[27]综合分析EFECT研究及SoFEA研究中晚期HR阳性乳腺癌病人，检测研究基线时病人血样本中ctDNA以评估雌激素受体1（estrogen receptor 1,ESR1）基因突变情况。研究发现基线时检测到ESR1与更短的无进展生存期（progression free survival，PFS）相关，提示不良预后。

二、MRD与临床复发时间间隔

MRD检测是否可较影像学检查或临床症状更早诊断乳腺癌的进展与转移？Coombes等[7]对EBLIS研究中完成标准治疗且影像学检查阴性的早期乳腺癌病人进行ctDNA检测并随访。发现MRD阳性与临床症状和影像学检查比较，提前中位8.3个月提示疾病进展。与肿瘤指标CA15-3比较，可提前中位200 d提示肿瘤复发。其预测复发事件的灵敏度为89%，特异度为100%。Lipsyc-Sharf等[11]则聚焦于高危HR阳性、HER2阴性乳腺癌病人，利用肿瘤知情分析策略每6～12个月对术后病人行血样本MRD检测。同样发现相较于临床症状的出现，ctDNA-MRD对转移病灶的识别可提前中位时间约12.4个月。但值得注意的是，部分临床研究在随访过程中对无临床复发症状的术后病人未进行常规影像学复查[11]，故ctDNA-MRD的获益应综合考虑影像学检查未能及时随访发现复发的情况。Trapp等[25]利用CellSearch系统对已完成治疗的高危早期乳腺癌病人CTC状态随访，随访期间发生DFS事件的101例病人中，仅有36例（35.6%）在随访期间检测到CTC阳性，提早预测复发的敏感性较低，可能与其检测方法灵敏度不足及CTC在血样本中含量较低相关。

晚期乳腺癌中，ctDNA的动态监测亦可更早监测到病情进展。Dawson等[28]对转移性乳腺癌病人，在全身治疗期间约每3周或更长时间间隔，连续收集血样本及影像学信息发现，ctDNA的升高与CT影像学改变比较，可提前约5个月发现疾病进展。且当疾病进展时，ctDNA水平的提升相较于肿瘤指标CA15-3的升高显著，可较敏感地反映疾病进展。

三、MRD与药物治疗疗效

MRD已被证实与肿瘤负荷密切相关，那么动态监测MRD变化，是否可预测治疗的反应？

针对乳腺癌的化疗，I-SPY2研究[12]证实MRD对化疗疗效的预测。该研究对接受新辅助化疗的乳腺癌病人在治疗开始前、新辅助化疗中及手术开始前进行基于肿瘤原发灶突变基因的ctDNA连续检测发现，病人ctDNA阳性率在新辅助治疗过程中可能下降。治疗后ctDNA阴性的病人较ctDNA阳性者，治疗反应和预后更好，证实监测MRD状态能预测新辅助化疗的疗效。在辅助化疗阶段，MRD亦可指导治疗。既往研究发现，血液系统肿瘤，尤其是急性淋巴细胞白血病，化疗后的巩固治疗过程中，如出现MRD阳性，提示复发风险较高，需进行个体化加强治疗[29]。对于实体瘤，目前有较多的研究聚焦于是否可根据MRD结果指导辅助治疗的选择。LUNGCA-1研究[30]利用肿瘤知情策略对接受手术的NSCLC病人在术后的第3天及1个月时行ctDNA-MRD检测，并根据病人术前的临床分期决定术后辅助治疗与否。研究发现，辅助治疗能为术后MRD阳性病人带来生存获益，未改善术后MRD阴性病人的预后。DYNAMIC研究[14]则将接受手术的Ⅱ期结肠癌病人随机分为MRD指导管理组与标准管理组。前者通过肿瘤知情分析策略在手术后第4周及第7周检测ctDNA-MRD状态，对病人进行危险分层。MRD阳性病人进行辅助治疗，阴性病人豁免治疗。标准管理组则基于传统临床病理学指标决定辅助治疗策略。研究发现，基于ctDNA-MRD状态的辅助治疗策略相较于基于传统病理学特征，能筛选出近半数病人安全豁免化疗，而两组间的2年及3年无复发生存期差异无统计学意义，提示MRD可指导早期结肠直肠癌病人辅助治疗选择。然而，目前基于MRD状态制定早期乳腺癌病人辅助化疗策略尚无前瞻性临床研究结果，有待进一步研究探索。

在乳腺癌周期蛋白依赖性激酶 （cyclin-dependent kinases,CDK4/6）抑制剂、免疫治疗、PARP抑制剂等靶向治疗过程中，由于药物治疗的选择压力，部分肿瘤细胞会发生新的突变，与耐药相关，降低治疗反应[31]。提示如早期发现耐药相关基因突变，并及时更换治疗方案，可能改善预后[32]。前瞻性PADA-1[13]研究对正在接受CDK4/6抑制剂与芳香化酶抑制剂治疗的雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性、HER2阴性的转移性乳腺癌病人，每2个治疗周期采集1次血样本以检测ctDNA的ESR1突变情况。研究者发现对治疗过程中出现ESR1突变的病人，更换为CDK4/6抑制剂联合氟维司群，可提高PFS约6.2个月，降低死亡相关风险39%。提示在治疗过程中利用ctDNA监测新发突变并及时更换耐药药物，可明显改善生存。目前亦有多项结合MRD检测结果与乳腺癌靶向治疗方案选择的临床研究正在进行中[33]。c-TRAK-TN研究 （NCT03145961）旨在评估新辅助治疗后，ctDNA阳性早期TNBC病人接受帕博利珠单抗免疫治疗的临床获益。DARE研究（NCT04567420）和LEADER研究（NCT03285412）聚焦于 CDK4/6抑制剂在 MRD阳性、ER阳性乳腺癌病人中的临床治疗获益。ZEST研究（NCT04915755）则评估PARP抑制剂尼拉帕尼在MRD阳性、BRCA突变TNBC病人中的疗效和安全性[33]。上述临床研究将对利用MRD检测阳性结果指导高危乳腺癌个体化辅助治疗提供理论依据。

结 语

针对ctDNA及CTC的MRD检测具有无创性、可重复性及高敏感性等特点，较影像学检查和临床症状更好地预测疾病复发，并指导药物选择以及强化辅助治疗方案的制定。在乳腺癌治疗中，针对ctDNA检测的MRD有较好的临床指导价值。随着临床研究的深入以及临床检测技术的提高，MRD有助于乳腺癌个体化治疗的完善。