MWCNT-PEI对细菌菌膜生长和结构的影响

余益成，王珊珊，殷 敏，吕 敏

（上海师范大学化学与材料科学学院，上海 200234）

0 引言

细菌菌膜是细菌附着在生物或非生物表面，生长为由自身产生的胞外聚合物基质（EPS）包裹的多细菌群落［1］.其中，由多糖、蛋白质和胞外DNA等生物大分子交联形成的黏性EPS对细菌起着重要的保护作用.因此，菌膜被认为是细菌抵御环境风险和压力的重要生存模式.这种生长方式极大地影响着人类的生活环境和健康安全，备受生物医学、工业和地理环境等领域关注［2-3］.菌膜对环境和健康的影响有利有弊：一方面，致病细菌菌膜诱发的急慢性感染疾病，严重威胁着人类的健康和安全［4-6］；另一方面，有益的细菌菌膜在处理地球物质循环、工厂废水和降解有毒化合物生物等方面发挥着积极作用.细菌菌膜的生长与周围环境条件密切相关，环境条件的改变会导致菌膜结构和组成的改变［7-8］.因此，维持环境稳态对于细菌菌膜实现环境物质分解和循环起着至关重要的作用.

纳米科技的兴起和发展，涌现出大量具有优异抗菌性和抗菌膜特性的纳米材料，比如金属纳米颗粒、金属氧化物纳米颗粒以及碳族纳米材料［9-12］.特别是多壁碳纳米管（MWCNT）作为一种优异的纳米抗菌材料受到了广泛关注.CHEN等［13］发现单壁碳纳米管和MWCNT可以通过膜去极化抑制细菌生长.近年来，研究发现碳纳米管对菌膜的生长也有显著的影响.在菌膜形成的初始阶段，单壁碳纳米管与细菌相互作用并抑制其生长；但是，成熟菌膜对碳纳米管具有高度抗性.这是因为在成熟的菌膜中，细菌分泌大量的胞外多聚物减轻了碳纳米管的毒性［14-15］.由于碳纳米管具有大的比表面积和丰富的官能团，研究人员构建了丰富多彩的功能化碳纳米管［16］.其中，多聚物修饰碳纳米管不仅改善了碳纳米管在生理介质中的分散性，而且因其兼具碳纳米管和多聚物材料的特殊理化性质，被广泛用于涂料包装、橡皮筋、垃圾袋等原材料［17-18］.这些塑料产品最终将随着消费使用结束释放到环境中，会与微生物群落发生强烈的相互作用，这种作用是否会导致细菌个体及群体生长的改变，成为纳米毒理学和环境科学领域关注的焦点.

本文作者利用共价接枝的方法合成了MWCNT接枝聚乙烯亚胺（MWCNT-PEI）；选择诱发呼吸道囊性纤维化疾病的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）为模式菌株，系统研究了MWCNT-PEI与浮游细菌和菌膜的相互作用.结果显示：MWCNT-PEI可以有效抑制铜绿假单胞菌生长，而且抗菌作用还呈现浓度依赖性.此外，MWCNT-PEI会影响菌膜的生长周期，导致菌膜成熟期提前；高浓度MWCNT-PEI促使菌膜分散期提前.另外，MWCNT-PEI会改变成熟菌膜的结构组成，刺激细菌分泌大量的EPS.这些结果为深入理解纳米材料与菌膜相互作用提供了新理论，也为评估碳纳米材料对环境微生物的影响提供了科学指导.

1 材料与方法

1.1 材 料

肉汤培养基（LB）和琼脂粉（Agar），均采购于生工生物工程（上海）股份有限公司；浓硫酸、浓硝酸、MWCNT和支化聚乙烯亚胺（PEI），均采购于西格玛奥德里奇贸易有限公司（Sigma-Aldrich）；SYTO9绿色荧光核酸染料购自英潍捷基贸易有限公司（Invitrogen）；Alexa Fluor™594与刀豆蛋白A的偶联物和结晶紫（CV）均采购于赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific）.

1.2 实验仪器

紫外分光光度仪（Shimadzu UV-18000）；超声速离心机（Beckman Coulter DU 730）；透射电子显微镜（TEM，JEOL 2100）；动态光散射分析仪（DLS，Malvern Nano-ZS90）；酶标仪（Thermo Multiskan MK3）；离心机（Eppendorf Centrifuge 5424R）；超声机（XM300UHP）；激光共聚焦显微镜（Leica TCS SP8）；恒温培养箱（LRH-70F）；恒温震荡培养箱（THZ-C-L）；垂直层流净化工作台（CA-920-2）.

1.3 实验方法

1.3.1 MWCNT-COOH的制备

0.75 g MWCNT分散于60 mL浓硫酸和20 mL浓硝酸中，在60℃，460 r·min-1条件下反应6 h.待反应完，反应体系静置、冷却至室温.然后，真空抽滤，洗涤至中性pH=7，得到羧基化酸化的多壁碳纳米管（MWCNT-COOH）.在冰面上超声30 min，超声探针尖端6 mm，振幅10%.测得500 nm处吸光度（按吸光系数39.92 mg·mL-1计算），计算MWCNT-COOH质量浓度［19-20］.

1.3.2 MWCNT-PEI的制备

将MWCNT-COOH与PEI按质量比为1∶10的比例在水溶液中混合，超声10 min；在84℃，460 r·min-1条件下反应16 h.待反应停止，冷却至室温，用孔径为0.45 μm的滤膜进行真空抽滤，洗去未反应的PEI，反复洗10次.将MWCNT-PEI冷却至室温，真空烘干.

1.3.3 铜绿假单胞菌的培养

取3 μL冻于-80℃的铜绿假单胞菌液接种于3 mL LB肉汤培养基，摇床（37℃，220 r·min-1）过夜培养，取对数期生长的菌液在琼脂平板上划线培养，长出单菌落，保存4℃冰箱中备用.

1.3.4 MWCNT-PEI对浮游铜绿假单胞菌生长的影响

挑取备用琼脂平板的单菌落于3 mL的LB中，摇床（37℃，220 r·min-1）培养过夜.取1 mL对数期菌液离心（10 000 r·min-1，30 s），磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗2次，去掉死细菌.稀释后，用分光光度计测600 nm处的吸光度数值（OD600），确定细菌浓度（即每毫升的菌落数）.分散于PBS的细菌（终浓度约为107CFU·mL-1）与不同质量浓度的MWCNT-PEI（5，10，20 μg·mL-1）作用60 min，用平板计数法数细菌数目，计算细菌存活率：

1.3.5 MWCNT-PEI对细菌菌膜生长动力学的影响

细菌浓度为105CFU·mL-1的50 μL菌悬浮液加入96孔板，然后加入50 μL MWCNT-PEI，使其最终质量浓度为0，5，10，20 μg·mL-1，放置培养箱进行培养.选取细菌菌膜生长过程中不同时间点（2，6，20，24，28，36和48 h）测定的细菌菌膜的生物量.

CV染色法可用于细菌菌膜生物量的测定.生长到一定时间点的菌膜，用PBS轻轻地洗3次，去除悬浮细菌，自然风干3 min.然后，用质量分数为0.1%的CV染液染色15 min，吸去CV染液后，用PBS洗3次，再加入体积分数为95%乙醇脱色15 min，酶标仪测试595 nm处的吸光值.

1.3.6 MWCNT-PEI对细菌菌膜结构的影响

使用激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）研究菌膜的结构，终浓度为107CFU·mL-1的菌液加入24孔板，然后分别加入质量浓度为0，5，10，20 μg·mL-1的MWCNT-PEI，进行培养.培养24 h后，PBS洗1次，荧光染料SYTO9（激发光/发射光为488/500 nm）染色15 min，洗去多余染料；再用Alexa Fluor™594（激发光/发射光为561/590 nm）与刀豆蛋白A的偶联物染色20 min；最后，用CLSM进行观察，以z轴步长为1 μm扫描菌膜获取3D菌膜图，所得3D图像通过LAS AF软件进行分析，确定MWCNT-PEI对细菌菌膜的结构的影响.

2 结果与讨论

2.1 MWCNT-PEI的合成与表征

MWCNT羧基化后，通过共价接枝的方法制备MWCNT-PEI，如图1（a）所示［21］.使用TEM观察碳纳米管的形貌，如图1（a）和1（c）所示，结果显示：混酸处理的MWCNT-COOH和MWCNT-PEI结构完整，呈管状结构；MWCNT和MWCNT-PEI的直径分别约为11 nm和13 nm，说明MWCNT-COOH表面接枝了PEI.Zeta电位测试佐证了MWCNT-PEI的成功合成.如图1（d）所示，MWCNT-COOH带负电，电位为-55.4 mV；当接枝带正电的PEI后，MWCNT-PEI的Zeta电位上升到47.7 mV.碳纳米材料的分散性与生物效应密切相关［22］.因此，评估了MWCNT在不同介质中的稳定性.如图1（e）所示，MWCNT-PEI在多种介质中都能保持良好的稳定性和分散性.

图1 MWCNT-PEI的合成及表征.（a）MWCNT的TEM图；（b）MWCNT的粒径分析图；（c）MWCNT-PEI的TEM图；（d）MWCNT-PEI的粒径分析图；（e）Zeta电位图；（f）不同介质中的稳定性

2.2 MWCNT-PEI抑制浮游细菌生长

碳家族纳米材料包括零维富勒烯、一维碳纳米管、二维石墨烯等碳纳米材料及其衍生物，它们作为一类新型纳米抗菌材料在纳米生物学领域备受关注［23-25］.大量报道证实，MWCNT有优良的抗菌性能［13］，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌等革兰氏阳性菌和阴性菌都有很好的抑制和杀灭效果.采用平板计数法评估了MWCNT接枝多聚物后对铜绿假单胞菌活力的影响.结果如图2所示，与对照组相比，铜绿假单胞菌在不同浓度MWCNT-PEI（5，10，20 μg·mL-1）暴露60 min后，细菌数量随MWCNT-PEI质量浓度的增加而减少.MWCNT-PEI为5 μg·mL-1时，超过50%的细菌失活；MWCNT-PEI的质量浓度增加到20 μg·mL-1时，几乎没有细菌存活，杀菌率高达96%.以上结果表明：MWCNT-PEI具有优异的抗菌性能，可以有效抑制铜绿假单胞菌生长，而且这种抗菌能力还呈现浓度依赖性.

图2 MWCNT-PEI的抗菌性.

2.3 MWCNT-PEI对菌膜形成的影响

菌膜是细菌在自然界的主要生存方式.研究发现：菌膜形成是一个动态过程，主要包括4个阶段：1）细菌不可逆地附着在生长基底表面上；2）黏附的细菌细胞进行分裂增殖，形成细菌团，同时产生大量的胞外多聚物基质（EPS）；3）形成成熟细菌菌膜；4）菌膜分散，即菌膜内的细菌分散逃逸，形成新的聚集体，开始新一轮菌膜形成［6］.环境因素（例如抗菌剂［26］、机械压力［27］或渗透压［28］等）显著影响菌膜的形成和结构.多聚物修饰MWCNT的广泛研究和应用使其在环境中的释放量不断增加［18］.在浮游细菌中加入MWCNT-PEI，模拟碳纳米管释放到环境中与细菌相互作用，观察其对菌膜形成的影响.

CV染色观察和分析（图3）显示，正常菌膜和不同质量浓度MWCNT-PEI处理的菌膜都经历了相似的生长阶段和生长趋势.它们都是从最初的黏附到逐渐成熟的生物膜，生物量不断增大，最终达到峰值；成熟菌膜因为营养匮乏和氧气压力等原因［6］，开始弥散形成新的细胞团，生物量开始显著减少.但是，MWCNT-PEI促使菌膜提前到达成熟期，正常菌膜在20 h后到达成熟期，MWCNT-PEI处理后的菌膜12 h后已趋于成熟.这种现象可能是因为低浓度的碳纳米管不足以杀死所有的细菌，而且碳纳米管大的比表面积使其能够吸附生物大分子，为细菌生长提供支点［29］.高浓度MWCNT-PEI（20 μg·mL-1）还会导致菌膜的分散时间提前到36 h.这可能是在菌膜的形成过程中，由于氧气和营养物的减少，导致菌膜提前进入分散期.然而，MWCNT-PEI对成熟菌膜的最大生物量几乎没有影响.

图3 MWCNT-PEI对铜绿假单胞菌菌膜生长的影响.（a）菌膜的CV染色图；（b）将细菌分别与不同质量浓度的MWCNT-PEI（0，5，10和20 μg·mL-1）作用48 h的菌膜生长曲线

2.4 MWCNT-PEI对成熟菌膜结构的影响

为了深入分析成熟菌膜的结构，用SYTO9和Alexa Fluor™594与刀豆蛋白A的偶联物分别标记菌膜中的细菌和EPS，使用CLSM进行荧光成像和定量分析.如图4（a）所示，与对照组相比，MWCNT-PEI的加入导致成熟菌膜中绿色荧光的强度减弱，红色荧光增强，这说明MWCNT-PEI会导致成熟菌膜中的细菌数目减少，EPS分泌量提高.细菌抵御抗菌剂时，会启动应激保护机制，即分泌大量EPS包裹自身，阻挡或隔绝抗菌剂的直接作用.图4（b）为荧光图量化数据，与对照组相比，MWCNT-PEI显著降低了菌膜厚度，这与材料具有抗菌性相关.而质量浓度为10 μg·mL-1的MWCNT-PEI刺激细菌分泌大量EPS，这说明亚致死量的抗菌剂诱发细菌启动了应激机制.尽管MWCNT-PEI对成熟菌膜的总生物量几乎没有影响，但是会影响菌膜的结构组成（细菌数目降低，EPS分泌增加），这对于菌膜处理工厂的污水有着非常重要的应用价值.

图4 菌膜荧光染色图像.（a）铜绿假单胞菌菌膜的3D-CLSM图；（b）不同质量浓度下（0，5，10和20 μg·mL-1）菌膜中的细菌、EPS生物量的高度分布图

3 结论

综上所述，本工作探究了环境变化（碳纳米材料的释放）对细菌及菌膜的影响.利用羧基化和共价接枝方法制备了一种具有良好水分散性和稳定性的MWCNT-PEI，这种碳纳米材料具有优异的抗菌性，质量浓度为20 μg·mL-1时，在1 h内几乎可以杀死所有的铜绿假单胞菌.同时，MWCNT-PEI会影响菌膜生长，导致菌膜成熟期提前，以及成熟菌膜结构和组分发生改变（细菌数目降低，EPS分泌提高）；高浓度MWCNT-PEI会诱发菌膜的分散期提前.这些结果说明释放于环境中的碳纳米材料会对生态环境造成压力，破坏环境微生物的生存和稳态.因此，未来大规模投产和应用纳米材料前，除了分析其潜在的生物毒性，还需要系统评估其产生的环境风险.