一种快速评价小反刍兽疫疫苗效果方法建立

闫修阳，毛爱民，郑砚超，冯嘉林，韩奇宏，陆宇超，金嘉旻

（1.无锡中德伯尔生物技术有限公司，江苏 无锡 214174； 2.无锡市水产畜牧技术推广中心，江苏 无锡 214026）

小反刍兽疫（ Peste des petits ruminants，PP R）是由小反刍兽疫病毒（ Peste des petits ruminants virus，PPRV）引起的一种急性病毒性传染病，主要感染山羊和绵羊。以高热、口炎、胃炎、腹泻和肺炎为特征。该病一年四季均可发生，易感羊群的发病率和病死率最高可达90%以上，该病是OIE法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。近年被纳入国家动物强制免计划，由各级畜牧兽医主管部门具体组织实施。由于疫苗的种类，羊的个体差异等疫因素其注射疫苗后产生抗体能否达到保护作用浓度，需要进行检测；目前检测手段为Elisa方法；本文对一种快速检测试纸条的制备，及其性能与Elisa试剂盒进行了比对。

1 材料与方法

1.1 试纸条制备

1.1.1 试纸条制备所用试剂

小反刍兽疫蛋白、金标复溶液：中德生物自产；羊抗兔二抗、兔抗：南京梓轩生物；氯金酸（HAuCl4）：分析纯，美国Sigma公司；柠檬酸三钠：分析纯，国药集团；牛血清白蛋白（BSA）：分析纯，赛宝生物；其他试剂：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；PVC底板、NC膜、金标垫、样品垫、吸水垫：上海捷宁生物科技有限公司。

1.1.2 胶体金制备

称取1.0 g氯金酸（HAuCl4），用超纯水溶解后定容成1%的水溶液，0.45µm过滤后于4℃避光存放备用。称取1.0g柠檬酸三钠，用超纯水溶解后定容成1%的水溶液，0.45µm过滤后于4℃避光存放备用。在磁力搅拌下，将2ml 1%氯金酸加入200ml的蒸馏水中加热至沸腾，再向溶液中迅速加入2.7 ml柠檬酸三钠，继续加热5min待溶液变为酒红色[1]。将溶液放置室温使其自然冷却，用分光光度计、电镜扫描等，计算金胶体金颗粒直径。

1.1.3 胶体金偶联蛋白

用上述制备的胶体金分别偶联兔抗、小反刍兽疫蛋白，其过程包括：最适pH、最佳蛋白偶联浓度的确定；将制备好的金标偶联物以合适的喷金量，用喷金仪进行喷金于金标垫上，37℃干燥2h备用。

1.1.4 NC膜制备

以小反刍兽疫抗原作为NC膜上的检测线（T线），羊抗兔二抗作为质控线（C线），用PBS缓冲液（pH7.4，0.01mol/L，1% 甲醇）稀释20倍（浓度为1.0 mg/ml），用喷膜仪以喷量1.0μl/cm喷于NC膜上；在检测线上5mm处以喷量1.0μl/cm喷涂羊抗兔二抗（0.07mg/ml），将包被好的NC膜置于37℃干燥2h备用。

1.1.5 样本垫、金垫制备

将样品垫置于含1%BSA、2%葡萄糖、pH8.0、0.1mol/L 的Tris缓冲液中浸泡2分钟，取出后50 ℃干燥2 h备用；将金标垫置于含3%蔗糖、0.5%BSA、pH7.4、0.2mol/L的PBS缓冲液中均匀浸湿5分钟，50℃干燥2h后备用。

1.1.6 试纸条制备

把NC膜、金标垫、样品垫、吸水垫贴在PVC底板上，使样品垫与金标垫重合0.2cm（长度方向上），金标垫与NC膜重合0.2cm（长度方向上），NC 膜与吸水垫重合0.3cm（长度方向上），组装并切割成条。

1.1.7 试纸条灵敏度评价

将上述制备好的试纸条进行性能测试，性能需达到检测稀释液时，只出现C线；检测阴性样本时，只出现C线；检测阳性样本（疫苗免疫成功，抗体达到一定浓度）出两条线。

1.1.8 试纸条批内差异

取同个批号的试纸条，取不同块大板的前、中、后各10条卡，测试同一个阳性样本，肉眼观察检测卡T、C线显色均匀且一致，用扫描仪对色度进行量化，T、C的CV值分别在5.8%、6.2%；批内差异较小。

1.1.9 试纸条批间差异

取3个批号的试纸条，每批号各取10卡平行，测试同一个阳性样本，检测结果，30卡T、C线显色均匀且无明显差异，用扫描仪对色度进行量化，T、C的CV值分别在6.0%、6.5%；批间差异较小。

1.1.10 试纸条稳定性数据

稳定性对于任何一种试纸条而言都是重要的性能参数，为了更好地测定实验研制试纸条的稳定性，采用将试纸条保存于室内常温25℃、烘箱50℃加速老化，每隔5d进行一次检测，监控一个月，同时将不同时间测试的数据进行保存比较，观察性能变化情况；一个月后对检测卡进行检测，其性能可以达到第一天的效果，测试与第0天相同样本，T线有8.7%下降，C线有9.2%下降。稳定性能稳定。

2 Elisa试剂盒信息

小反刍试剂盒：厂家ID.VET 批号：2021.06.10

3 血清样品信息

血清样本由无锡动卫所提供。

4 结果及分析

用制备的胶体金检测卡，测试动卫所收集的91份血清；同时用ID.VET小反刍ELISA试剂盒对这91份血清进行测试；将两者测试结果进行比对，观察吻合效果；胶体金测试结果，阴性为只有C线，阳性有T、C两条线，结果如图1、图2、图3；Elisa测试结果如表1。

表1 Elisa测试结果

图1 胶体金测试结果1

图2 胶体金测试结果2

图3 胶体金结果3

结果：共测试了91份样本，胶体金的结果与小反刍ID.VET ELISA试剂盒结果吻合度较高可以达到98.9%（90/91），其中一份判读不吻合的样本，ELisa结果为疑似样本，胶体金检测卡判读阴性。

5 结论

胶体金检测卡与ELisa结果吻合度较高，可初步替代ELisa进行测试；性能基本吻合的情况下，胶体金可体现出，检测时间短，操作简单，不需要仪器设备等较多优点，后续可以继续增加大量样本测试。

鉴于Elisa试剂盒测试出的可疑样本，胶体金测试出的弱阳性样本，对此类样本建议重复测试，一旦结果依旧为疑似样本，或者弱阳性样本，建议加强免疫等增加免疫抗体。