废弃剩余冷冻胚胎的相关因素分析

葛秀云

（临沂市妇幼保健院生殖中心，山东 临沂 276000）

体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）技术的普遍应用，为广大不孕不育夫妇带来希望。在该技术助孕过程中，每次移植1～2枚胚胎，如果获得了大量胚胎，移植后仍有剩余胚胎或因有卵巢过度刺激的风险无法进行鲜胚移植，需将胚胎进行冷冻保存，如上次移植未妊娠或等待合适时机再进行胚胎解冻移植，可提高胚胎的利用率、临床妊娠率及辅助生殖技术的安全性，尤其多囊卵巢综合征患者行冻胚移植可明显降低中重度卵巢过度刺激综合征的发生风险。因此，随着辅助生殖技术的不断发展及单胚胎移植策略的广泛应用，全国各地的生殖中心剩余大量的冷冻胚胎。据报道，在夫妇双方完成生育需求后，仍有28%的辅助生殖助孕周期有剩余的胚胎[1]。由于成熟、安全的胚胎冷冻技术，随着时间的推移，冷冻胚胎的数量逐渐增加，由于我国尚未建立完善的剩余胚胎相关的法律、法规，大量剩余胚胎已成为医疗机构面临的重要问题，同时，也带来相应的伦理和法律问题。基于此，本研究旨在探讨影响助孕夫妇废弃剩余胚胎的相关因素，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料回顾性分析2014年至2016年于本中心接受辅助生殖助孕技术助孕后仍有剩余冷冻胚胎的387对夫妇的临床资料，根据是否废弃剩余胚胎，分为废弃组（n=96）和保存组（n=291）。两组夫妻女方平均年龄（31.42±4.51）岁，男方平均年龄（33.14±5.52）岁。本研究经本院医学伦理委员会审核批准。纳入标准：夫妻婚姻关系存续者；夫妻均对本研究知情同意并签署知情同意书；所有夫妇均续交冷冻保存费用或签署废弃剩余胚胎知情同意书。排除标准：失访者；暂时无法明确选择者。

1.2 方法

1.2.1 胚胎的获得对女方采用长方案、拮抗剂方案等进行超促排卵，常规经阴道超声进行监测，并结合性激素水平，当2个主导卵泡直径＞18 mm或同时有3个卵泡达17 mm（血雌二醇达到平均每个优势卵泡200～300 ng/L）进行扳机，并于34～36 h取卵。男方同时取精，采精前禁欲2～7 d，女方取卵当天采用手淫法取精。卵子取出后放置于37℃，6%CO2培养箱中，在取卵后3～4 h或注射人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）后39～40 h授精。选用Vitrolife培养系统，受精卵在体外培养24 h（D2）和48 h（D3），观察胚胎细胞分裂情况。包括观察时间、细胞数、大小是否均匀、碎片多少、空泡、多核等。并给予胚胎评级，可用胚胎包括1～3级，优质胚胎包括1～2级。冷冻D3胚胎2枚，其余行囊胚培养。第5天（D5）观察，若有可用囊胚形成，则进行移植或冷冻，否则继续培养至第6天（D6）。

1.2.2 冷冻胚胎①适应证：在体外受精（in vitro fertilization，IVF）过程中除去新鲜的胚胎植入外，仍有质量良好的胚胎剩余。由于某种病理原因无法接受新鲜胚胎植入的女性，如卵巢过度刺激综合征、子宫内膜状况不良、不明原因的阴道出血；由于某种非医学原因不能接受新鲜胚胎植入的女性，如发生家庭或个人意外事件，因某种原因不能稳定情绪者。②操作流程：采用玻璃化冷冻，将平衡液（equilibration solution，ES）、冷冻液（vitrification solution，VS）从冰箱中取出，室温恢复30 min。填写胚胎冷冻记录表，确认胚胎存放位置。将冷冻管从包装袋中取出，贴上写有夫妇双方的姓名、载杆序号的标签。在冷冻支架上标记双方姓名、冷冻位置。准备1桶2/3高度的液氮置于桌面待用。拔出载杆置于吸管架上待用，将其外套管放于手边台子上。在无菌3002皿盖上做ES液滴，核对身份后将要冷冻的胚胎转入ES液中，停留6～9 min。提前1 min在无菌3002皿盖上做VS液滴，将胚胎从ES液转入VS液中。60 s内将胚胎转到载杆的平板上（尽量少的吸取VS液），投入液氮，在液氮中将外套管套紧，载杆装入之前投入液氮的做好标记的冷冻支架的塑料套管内，双人核对无误后放入液氮贮藏罐相应位置保存。

1.2.3 废弃胚胎夫妇双方向门诊大夫申请废弃剩余冷冻胚胎。由护士长询问夫妇双方意愿，若夫妇双方坚持废弃，则预约废弃时间（至少2周后）。给予患者前台电话并告知，若在预约日期前放弃废弃自身胚胎，则电话取消预约。预约当天，在确认夫妻双方意愿后，核对夫妇双方身份证信息是否与本人一致，由护士长带领患者进入实验室并与实验室技术人员交接。首先，实验室人员询问并确认患者意愿。在得到坚决要废弃的回复后，由1名实验室人员取出胚胎，与夫妇双方和另1名实验室人员核对提桶及载杆上面的患者信息及剩余冷冻胚胎数。然后从液氮中将载杆拿出，拔掉帽子，将胚胎暴露于空气中。实验室人员在废弃记录上签字。

1.2.4 随访移植后14 d抽血检查hCG水平，未升高者提示着床失败，升高者提示妊娠，继续黄体支持，两周后行B超检查，见孕囊为临床妊娠。确认妊娠后继续给予黄体支持至胚胎移植（embryo transfer，ET）后50 d逐渐减量，直至孕12周。孕12周内出现难免流产、胚胎停育者为自然流产。护士长于移植1年后随访继续妊娠者，包括询问生产情况及继续冷冻胚胎的意愿。如患者要求废弃剩余胚胎，则要求患者夫妇同时携带有效身份证件来中心按照流程废弃胚胎，如要求继续冷冻保存胚胎，则需来中心续交冷冻保存费用。

1.3 观察指标采用多元素Logistic回归模型分析废弃胚胎的影响因素。

1.4 统计学方法采用SPSS 20.0统计学软件分析数据，计量资料以“±s”表示，比较采用t检验，计数资料以[n（%）]表示，比较采用χ2检验，废弃胚胎的相关因素采用多因素Logistic回归分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 废弃胚胎的单因素分析 单因素分析结果显示，废弃胚胎可能受夫妇双方高中以下学历、助孕后孩次、冷冻时间、移植总次数的影响（P＜0.05），见表1。

表1 单因素分析废弃胚胎的影响因素Table 1 Univariate analysis of influencing factors of abandoned embryos

2.2 废弃胚胎的多因素Logistic回归分析将单因素分析中有统计学差异的因素纳入二元Logistic回归模型中。多因素Logistic回归分析显示，女方高中及以上学历、助孕后孩次≥3个、冷冻时间≥24个月是选择继续冷冻保存剩余胚胎的影响因素（P＜0.05）。

表2 废弃剩余冷冻胚胎的多因素分析Table 2 Multivariate analysis of discarding surplus cryopreserved embryos

3 讨论

本研究发现辅助生殖助孕夫妇在暂时完成生育需求后，仍有＞75%的夫妇选择继续冷冻胚胎。随着时代的发展，计划生育政策也在随之发生变化，2016年开始我国开始全面放开二孩生育政策，储存的剩余胚胎为助孕夫妇实践二孩政策提供便利。本研究结果显示，多因素Logistic回归分析显示，助孕后孩次≥3个是选择继续冷冻保存剩余胚胎的影响因素（P＜0.05）。在完成二胎及以上者仍有62%的夫妇选择继续冷冻胚胎，而继续冷冻剩余胚胎者最长胚胎冷冻时间为66个月，提示即使夫妇已经完成法定生育规定，仍有一部分夫妇对目前的生育政策处于观望状态，而不是急于废弃剩余的冷冻胚胎，导致生殖中心积压大量的剩余胚胎。而我国已于2021年5月31日实施三孩政策，生殖中心将迎来为生育三孩移植胚胎的高潮期。虽然根据我国冷冻胚胎保存时限[2]，胚胎保存6年内对妊娠结局无明显影响，且无足够证据表明＞6年会不利于胚胎的安全性，但据报道，随着胚胎冷冻时间越久，胚胎再次使用率也随之减少[3]。而由于胚胎的特殊性，目前国内绝大多数生殖中心采用只能根据助孕夫妇的意愿对胚胎进行处置。大量剩余胚胎将给生殖中心造成沉重负担并占用大量社会医疗资源，因此，完善管理剩余胚胎的相关法律法规具有重要意义。

完善剩余冷冻胚胎的相关行内规定和法律法规需要各个生殖中心数据的积累。国际上对于剩余胚胎的处理方法主要有继续保存、废弃、捐献科研或其他夫妇等。我国严格禁止胚胎赠送，而在德国、挪威、英国、澳大利亚、奥地利等国家，胚胎捐献给其他夫妇是一种可供选择的助孕措施[4]。而本生殖中心尚未开展胚胎相关科研，因此，无捐献科研选择。本研究结果显示，多因素Logistic回归分析结果显示，女方高中及以上学历是选择继续冷冻保存剩余胚胎的影响因素（P＜0.05）。表明是否废弃剩余胚胎与患者夫妇的年龄、婚姻状况是否为再婚、在职情况、移植总次数、剩余胚胎数目、剩余优质胚胎数目等无明显相关性，而女方高中以上学历则更倾向于选择继续冻存胚胎，是由于更高层次的教育背景可以更好的理解冷冻胚胎，相信胚胎冷冻保存技术的成熟性和安全性。有研究则认为影响患者夫妇对剩余胚胎处置的因素包括患者年龄、经济条件、婚姻状况、孩子的健康状况、宗教信仰、医生的建议、治疗周期后对胚胎属性的重新认识等[5]。而在CHANDY等[6]的一项对87对夫妇在完成生育计划后对剩余胚胎的处理决定的调查中发现，胚胎处置方式与夫妇的年龄、教育背景、收入及现有一孩均无相关性，37.9%的夫妇无法决定胚胎的处置方法，46%的夫妇愿意捐献给不孕夫妇，11.5%愿意捐献科研，27.6%夫妇认为捐献两者均可，只有3.4%的夫妇选择直接废弃。BRUNO等[7]则进一步探讨助孕夫妇关于胚胎的看法与剩余胚胎的处置方法之间的关系，发现两者有明显的相关性，如在助孕夫妇观念中胚胎代表孩子，他们更倾向于废弃胚胎；如果胚胎代表项目，他们倾向于捐献科研；如胚胎代表潜在的人，他们更倾向于捐献给其他人，而这些观念都受多方面尤其是社会文化的影响。国外研究表明，随着患者宗教信仰严格程度的增加，选择将剩余冷冻胚胎用于科学研究的比例呈下降趋势[8]。

本研究结果显示，多因素Logistic回归分析显示，冷冻时间≥24个月是选择继续冷冻保存剩余胚胎的影响因素（P＜0.05）。表明冷冻胚胎≥24个月者更倾向于继续冷冻胚胎，即使部分已经完成生育计划，这提示生殖中心即使在助孕夫妇进入周期前已经签订相关知情同意书，明确告知胚胎不可无限期保存，如超过保存年限，可选择销毁或者捐献科研，但由于我国法律尚未对胚胎的保存期限及早期胚胎的处置权有明确规定，且有学者研究发现约70%的患者在胚胎冷冻2～3年后会改变最初的处理方式[9-11]，因此，在处理剩余胚胎时仍应再次积极与助孕夫妇沟通，告知胚胎冷冻意义及风险，在充分尊重夫妇双方意愿的基础上确认胚胎处置方式，从而规避不必要的风险。而国际上已有许多国家立法或有专门的机构进行相关的管理，如英国的《人类受精和胚胎法》中就赋予生殖机构对过期的胚胎和配子处置的权利，其中明确规定精子和卵子的最长期限为10年，胚胎的最长保存期限为5年。超过规定时间的，医疗机构有权任其死亡[12]。

综上所述，辅助生殖治疗过程中剩余冷冻胚胎是否继续保存与女方学历、助孕后孩次、冷冻时间相关，生殖中心应根据影响因素制定合理的胚胎冷冻和随访策略。此外，我国生殖医学界临床医生应在能够获得适量的优质胚胎的前提下，尽量避免过量剩余胚胎的产生，完善冷冻胚胎的随访机制，从而减少医疗资源的浪费和过量剩余胚胎产生的相应伦理问题。